Protsesside standardiseerimine hõlmab nende optimeerimist ning sellele järgnevat kehtestamist ja ühtlustamist, võimaldades pikaajalist optimaalset jõudlust – kasutajast sõltumatult. Standardiseerimine tagab kvaliteetsed tulemused, samuti nende reprodutseeritavuse ja võrreldavuse.
(Klassikalise) PCR-i eesmärk on usaldusväärse ja reprodutseeritava tulemuse saamine. Teatud rakenduste puhul võib saagis olla ...PCR-produkton samuti oluline. Nende reaktsioonide puhul tuleb hoolitseda selle eest, et proove ei kahjustataks ja PCR-i töövoog jääks stabiilseks. Täpsemalt tähendab see saastumise minimeerimist, mis võib viia valepositiivsete või valenegatiivsete tulemusteni või isegi PCR-reaktsiooni pärssimiseni. Lisaks peaksid reaktsioonitingimused olema iga üksiku proovi jaoks ühe tsükli jooksul võimalikult identsed ja ülekantavad ka järgnevatele reaktsioonidele (sama meetodiga). See viitab nii reaktsioonide koostisele kui ka tsükleri temperatuuri reguleerimise tüübile. Kasutajavigu tuleks muidugi võimalikult palju vältida.
Allpool demonstreerime PCR-i ettevalmistamise ja läbiviimise ajal esinevaid väljakutseid ning lahendusi, mis on olemas PCR-i töövoogude standardiseerimiseks kasutatavate instrumentide ja tarvikute osas.
Reaktsiooni ettevalmistamine
Reaktsioonikomponentide jaotamine PCR-anumatesse või plaatidele hõlmab mitmeid väljakutseid, mis tuleb ületada:
Reaktsioonitingimused
Üksikute komponentide täpne ja korrektne doseerimine on hädavajalik võimalikult identsete reaktsioonitingimuste saavutamiseks. Lisaks heale pipeteerimistehnikale on kriitilise tähtsusega ka õige tööriista valimine. PCR-põhisegud sisaldavad sageli aineid, mis suurendavad viskoossust või tekitavad vahtu. Pipeteerimisprotsessi ajal põhjustavad need pipeti olulist märgumist.pipetiotsad, vähendades seeläbi pipeteerimise täpsust. Otsese doseerimise süsteemide või alternatiivsete pipetiotsikute kasutamine, mis on vähem märguvad, võib parandada pipeteerimisprotsessi täpsust ja korrektsust.
Saastumine
Doseerimisprotsessi käigus tekivad aerosoolid, mis pipeti sisemusse sattudes võivad järgmise pipeteerimisetapi ajal saastata järgmist proovi. Seda saab vältida filtriotsikute või otsenihutussüsteemide abil.
Tarbekaubad, näiteksnäpunäitedPCR-protsessis kasutatavad anumad ja plaadid ei tohi sisaldada aineid, mis kahjustavad proovi või võltsivad tulemust. Nende hulka kuuluvad DNA, DNaasid, RNaasid ja PCR-i inhibiitorid, samuti komponendid, mis võivad reaktsiooni käigus materjalist eralduda – ained, mida nimetatakse leostuvateks aineteks.
Kasutaja viga
Mida rohkem proove töödeldakse, seda suurem on vearisk. Võib kergesti juhtuda, et proov pipeteeritakse valesse anumasse või valesse süvendisse. Seda riski saab oluliselt vähendada süvendite kergesti eristatava märgistamise abil. Doseerimisetappide automatiseerimise abil minimeeritakse „inimfaktor“, st vead ja kasutajaga seotud variatsioonid, suurendades seeläbi reprodutseeritavust, eriti väikeste reaktsioonimahtude korral. See nõuab tööjaamas kasutamiseks piisava mõõtmete stabiilsusega plaate. Lisatud vöötkoodid pakuvad täiendavat masinloetavust, mis lihtsustab proovi jälgimist kogu protsessi vältel.
Termotsükleri programmeerimine
Instrumendi programmeerimine võib osutuda aeganõudvaks ja veaohtlikuks. Erinevad PCR-termotsükleri funktsioonid toimivad koos, et seda protsessietappi lihtsustada ja mis kõige tähtsam, muuta see ohutuks:
Lihtne kasutamine ja hea kasutajajuhendamine on tõhusa programmeerimise aluseks. Sellele alusele tuginedes hoiab parooliga kaitstud kasutajahaldus ära oma programmide muutmise teiste kasutajate poolt. Kui kasutusel on mitu (sama tüüpi) tsüklit, on kasulik, kui programmi saab otse ühelt instrumendilt teisele USB või ühenduvuse kaudu üle kanda. Arvutitarkvara võimaldab programmide, kasutajaõiguste ja dokumentide tsentraliseeritud ja turvalist haldamist arvutis.
PCR-analüüs
Protsessi käigus amplifitseeritakse DNA-d reaktsioonianumas, kus iga proovi tuleb allutada identsetele ja järjepidevatele reaktsioonitingimustele. Protsessi puhul on olulised järgmised aspektid:
Temperatuuri reguleerimine
Suurepärane temperatuuri reguleerimise täpsus ja tsükleriploki homogeensus on kõigi proovide ühtlase temperatuuri konditsioneerimise aluseks. Kütte- ja jahutuselementide (Peltieri elementide) kõrge kvaliteet ning nende plokiga ühendamise viis on otsustavad tegurid, mis määravad temperatuurierinevuste, mida tuntakse kui "servaefekti", riski.
Aurustumine
Üksikute reaktsioonikomponentide kontsentratsioonid ei tohiks reaktsiooni käigus aurustumise tõttu muutuda. Vastasel juhul on võimalik, et väga vähePCR-produktvõib tekkida või üldse mitte. Seetõttu on oluline minimeerida aurustumist, tagades kindla tihendi. Sellisel juhul toimivad termotsükleri kuumutatud kaas ja anuma tihend käsikäes. Saadaval on erinevad tihendusvõimalusedPCR-plaadid (link: Artikkel sulgemise kohta), kusjuures parim tihend saavutatakse kuumtihendamise teel. Sobida võivad ka muud sulgurid, kui tsükleri kaane kontaktrõhku saab valitud tihendile vastavaks reguleerida.
Protsessi standardiseerimine on kehtestatud täpsete ja reprodutseeritavate tulemuste pikaajaliseks tagamiseks. See hõlmab seadmete regulaarset hooldust, et tagada nende pidev hea töökord. Kõik tarbekaubad peaksid olema kõigis toodetud partiides ühtlaselt kõrge kvaliteediga ning nende usaldusväärne kättesaadavus peab olema tagatud.
Postituse aeg: 29. november 2022