La estandarización de procesos incluye su optimización y su posterior establecimiento y armonización, lo que permite un rendimiento óptimo a largo plazo, independientemente del usuario. La estandarización garantiza resultados de alta calidad, así como su reproducibilidad y comparabilidad.
El objetivo de la PCR (clásica) es generar un resultado fiable y reproducible. Para ciertas aplicaciones, el rendimiento de laproducto de PCRTambién es relevante. Para estas reacciones, se debe tener cuidado de garantizar que las muestras no se vean comprometidas y que el flujo de trabajo de PCR se mantenga estable. En concreto, esto se traduce en minimizar la introducción de contaminaciones que podrían provocar resultados falsos positivos o falsos negativos, o incluso inhibir la reacción de PCR. Además, las condiciones de reacción deben ser lo más idénticas posible para cada muestra individual dentro de una serie y también transferibles a reacciones posteriores (del mismo método). Esto se refiere a la composición de las reacciones, así como al tipo de control de temperatura en el ciclador. Por supuesto, los errores del usuario deben evitarse en la medida de lo posible.
A continuación, demostraremos los desafíos que se encuentran durante la preparación y durante toda la ejecución de una PCR, y los enfoques de soluciones que existen con respecto a los instrumentos y consumibles utilizados para la estandarización de los flujos de trabajo de PCR.
Preparación de la reacción
La dispensación de componentes de reacción en recipientes o placas de PCR, respectivamente, implica múltiples desafíos que deben superarse:
Condiciones de reacción
La dosificación exacta y precisa de cada componente es indispensable para lograr las condiciones de reacción más idénticas posibles. Además de una buena técnica de pipeteo, la selección de la herramienta adecuada es crucial. Las mezclas maestras para PCR suelen contener sustancias que aumentan la viscosidad o generan espuma. Durante el proceso de pipeteo, estas sustancias provocan una humectación considerable de la solución.puntas de pipeta, lo que reduce la precisión del pipeteo. El uso de sistemas de dispensación directa o puntas de pipeta alternativas menos propensas a la humectación puede mejorar la precisión del pipeteo.
Contaminaciones
Durante el proceso de dispensación, se generan aerosoles que, si llegan al interior de la pipeta, podrían contaminar otra muestra durante el siguiente paso de pipeteo. Esto se puede evitar mediante el uso de puntas con filtro o sistemas de desplazamiento directo.
Consumibles comoconsejosLos recipientes y placas utilizados en el proceso de PCR no deben contener sustancias que comprometan la muestra o falseen el resultado. Estas incluyen ADN, DNasas, RNasas e inhibidores de PCR, así como componentes que podrían filtrarse del material durante la reacción (sustancias conocidas como lixiviables).
Error de usuario
Cuantas más muestras se procesen, mayor será el riesgo de error. Es fácil que una muestra se pipetee en el recipiente o pocillo equivocado. Este riesgo se puede reducir considerablemente mediante un marcado fácilmente perceptible de los pocillos. Mediante la automatización de los pasos de dispensación, se minimiza el "factor humano", es decir, los errores y las variaciones relacionadas con el usuario, lo que aumenta la reproducibilidad, especialmente en el caso de pequeños volúmenes de reacción. Esto requiere el uso de placas con suficiente estabilidad dimensional en una estación de trabajo. Los códigos de barras adjuntos proporcionan una legibilidad mecánica adicional, lo que simplifica el seguimiento de las muestras durante todo el proceso.
Programación del termociclador
Programar un instrumento puede resultar laborioso y propenso a errores. Las diferentes características del termociclador PCR se combinan para simplificar este proceso y, sobre todo, para hacerlo seguro:
La facilidad de uso y una buena guía de usuario son la base de una programación eficiente. Sobre esta base, la administración de usuarios protegida por contraseña evitará que otros usuarios modifiquen sus programas. Si se utilizan varios cicladores (del mismo tipo), resulta beneficioso que un programa se pueda transferir directamente de un instrumento a otro mediante USB o conexión. El software permite la administración centralizada y segura de programas, permisos de usuario y documentos en un ordenador.
ejecución de PCR
Durante el análisis, el ADN se amplifica en el recipiente de reacción, donde cada muestra debe someterse a condiciones de reacción idénticas y consistentes. Los siguientes aspectos son relevantes para el proceso:
Control de temperatura
La excelente precisión en el control de temperatura y la homogeneidad del bloque ciclador son la base para un acondicionamiento uniforme de la temperatura de todas las muestras. La alta calidad de los elementos de calentamiento y enfriamiento (elementos Peltier), así como su conexión al bloque, son factores decisivos que determinan el riesgo de discrepancias de temperatura, conocido como "efecto borde".
Evaporación
Las concentraciones de los componentes individuales de la reacción no deberían cambiar durante el transcurso de la reacción debido a la evaporación. De lo contrario, es posible que muy poco...producto de PCRPuede generarse o no generarse. Por lo tanto, es crucial minimizar la evaporación asegurando un sellado seguro. En este caso, la tapa calefactada del termociclador y el sello del recipiente trabajan en conjunto. Existen diferentes opciones de sellado paraPlacas PCR (enlace: artículo sobre sellado)El mejor sellado se consigue mediante termosellado. Otros cierres también pueden ser adecuados, siempre que la presión de contacto de la tapa del ciclador se ajuste al sellado seleccionado.
Se ha implementado una estandarización de procesos para garantizar resultados precisos y reproducibles a largo plazo. Esto incluye el mantenimiento regular del equipo para garantizar su correcto funcionamiento. Todos los consumibles deben ser de alta calidad constante en todos los lotes producidos, y debe garantizarse su disponibilidad fiable.
Hora de publicación: 29 de noviembre de 2022