Die Standardisierung von Prozessen umfasst deren Optimierung sowie die anschließende Etablierung und Harmonisierung. So wird eine langfristig optimale Leistung – unabhängig vom Anwender – gewährleistet. Standardisierung gewährleistet qualitativ hochwertige Ergebnisse sowie deren Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit.
Das Ziel der (klassischen) PCR ist die Generierung eines zuverlässigen und reproduzierbaren Ergebnisses. Für bestimmte Anwendungen ist die Ausbeute derPCR-ProduktAuch bei diesen Reaktionen ist darauf zu achten, dass die Proben nicht beeinträchtigt werden und der PCR-Workflow stabil bleibt. Konkret bedeutet dies, den Eintrag von Kontaminationen zu minimieren, die zu falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen führen oder die PCR-Reaktion sogar hemmen könnten. Darüber hinaus sollten die Reaktionsbedingungen für jede einzelne Probe innerhalb eines Laufs möglichst identisch und auch auf nachfolgende Reaktionen (derselben Methode) übertragbar sein. Dies bezieht sich sowohl auf die Zusammensetzung der Reaktionen als auch auf die Art der Temperaturregelung im Cycler. Anwenderfehler sind selbstverständlich so weit wie möglich zu vermeiden.
Im Folgenden zeigen wir Ihnen, welche Herausforderungen bei der Vorbereitung und Durchführung einer PCR auftreten und welche Lösungsansätze es hinsichtlich der eingesetzten Instrumente und Verbrauchsmaterialien zur Standardisierung der PCR-Workflows gibt.
Reaktionsvorbereitung
Das Abfüllen der Reaktionskomponenten in PCR-Gefäße bzw. -Platten bringt mehrere Herausforderungen mit sich, die es zu bewältigen gilt:
Reaktionsbedingungen
Um möglichst identische Reaktionsbedingungen zu erreichen, ist die exakte und präzise Dosierung der einzelnen Komponenten unerlässlich. Neben einer guten Pipettiertechnik ist die Wahl des richtigen Werkzeugs entscheidend. PCR-Mastermixe enthalten häufig Substanzen, die die Viskosität erhöhen oder Schaum erzeugen. Diese führen beim Pipettieren zu einer starken Benetzung derPipettenspitzen, wodurch die Pipettiergenauigkeit verringert wird. Die Verwendung von Direktdispensiersystemen oder alternativen Pipettenspitzen, die weniger anfällig für Benetzung sind, kann die Genauigkeit und Präzision des Pipettiervorgangs verbessern.
Kontaminationen
Beim Dispensieren entstehen Aerosole, die, wenn sie ins Innere der Pipette gelangen, beim nächsten Pipettierschritt möglicherweise eine weitere Probe kontaminieren können. Dies lässt sich durch den Einsatz von Filterspitzen oder Direktverdrängungssystemen verhindern.
Verbrauchsmaterialien wieTippsGefäße und Platten, die im PCR-Workflow verwendet werden, dürfen keine Substanzen enthalten, die die Probe beeinträchtigen oder das Ergebnis verfälschen. Dazu gehören DNA, DNasen, RNasen und PCR-Inhibitoren sowie Bestandteile, die während der Reaktion potenziell aus dem Material austreten können – sogenannte Leachables.
Benutzerfehler
Je mehr Proben verarbeitet werden, desto höher ist das Fehlerrisiko. Es kann leicht passieren, dass eine Probe in das falsche Gefäß oder die falsche Vertiefung pipettiert wird. Dieses Risiko lässt sich durch eine gut lesbare Kennzeichnung der Vertiefungen deutlich reduzieren. Durch die Automatisierung der Dispensierschritte wird der „menschliche Faktor“, also Fehler und anwenderbedingte Abweichungen, minimiert, was die Reproduzierbarkeit, insbesondere bei kleinen Reaktionsvolumina, erhöht. Dies erfordert den Einsatz von Platten mit ausreichender Dimensionsstabilität in einer Workstation. Aufgebrachte Barcodes sorgen für zusätzliche Maschinenlesbarkeit und vereinfachen die Probenverfolgung während des gesamten Prozesses.
Programmierung des Thermocyclers
Die Programmierung eines Geräts kann zeitaufwändig und fehleranfällig sein. Verschiedene Funktionen des PCR-Thermocyclers vereinfachen diesen Prozessschritt und sorgen vor allem für seine Sicherheit:
Einfache Bedienung und eine gute Benutzerführung bilden die Grundlage für effizientes Programmieren. Darauf aufbauend verhindert eine passwortgeschützte Benutzerverwaltung, dass eigene Programme von anderen Benutzern verändert werden. Beim Einsatz mehrerer Cycler (des gleichen Typs) ist es vorteilhaft, wenn ein Programm per USB oder Konnektivität direkt von einem Gerät auf ein anderes übertragen werden kann. Computersoftware ermöglicht die zentrale und sichere Verwaltung von Programmen, Benutzerrechten und Dokumenten auf einem Computer.
PCR-Lauf
Während des Laufs wird die DNA im Reaktionsgefäß amplifiziert. Dabei sollten für jede Probe identische, gleichbleibende Reaktionsbedingungen herrschen. Folgende Aspekte sind für den Prozess relevant:
Temperaturkontrolle
Exzellente Temperaturgenauigkeit und Homogenität des Cycler-Blocks bilden die Grundlage für eine gleichmäßige Temperaturkonditionierung aller Proben. Die hohe Qualität der Heiz- und Kühlelemente (Peltier-Elemente) sowie deren Anschluss an den Block sind entscheidende Faktoren für das Risiko von Temperaturabweichungen, dem sogenannten „Edge-Effekt“.
Verdunstung
Die Konzentrationen der einzelnen Reaktionskomponenten dürfen sich im Laufe der Reaktion nicht durch Verdampfung verändern. Andernfalls kann es passieren, dass nur sehr wenigPCR-ProduktEs kann keine oder nur eine geringe Verdunstung entstehen. Daher ist es wichtig, die Verdunstung durch eine sichere Abdichtung zu minimieren. Der beheizte Deckel des Thermocyclers und die Abdichtung des Gefäßes arbeiten dabei Hand in Hand. Verschiedene Abdichtungsoptionen stehen zur Verfügung fürPCR-Platten (Link: Artikel zum Versiegeln), wobei die beste Abdichtung durch Heißsiegeln erreicht wird. Andere Verschlüsse können ebenfalls geeignet sein, sofern sich der Anpressdruck des Cycler-Deckels an die gewählte Abdichtung anpassen lässt.
Um präzise und reproduzierbare Ergebnisse langfristig zu gewährleisten, ist eine Prozessstandardisierung notwendig. Dazu gehört auch die regelmäßige Wartung der Geräte, um deren einwandfreien Zustand sicherzustellen. Alle Verbrauchsmaterialien müssen über alle produzierten Chargen hinweg von gleichbleibend hoher Qualität sein und ihre zuverlässige Verfügbarkeit muss gewährleistet sein.
Veröffentlichungszeit: 29. November 2022