L'estandardització dels processos inclou la seva optimització i el posterior establiment i harmonització, permetent un rendiment òptim a llarg termini, independentment de l'usuari. L'estandardització garanteix resultats d'alta qualitat, així com la seva reproductibilitat i comparabilitat.
L'objectiu de la PCR (clàssica) és la generació d'un resultat fiable i reproduïble. Per a certes aplicacions, el rendiment de laproducte de PCRtambé és rellevant. Per a aquestes reaccions, cal tenir cura d'assegurar-se que les mostres no es vegin compromeses i que el flux de treball de la PCR es mantingui estable. En concret, això es tradueix en minimitzar la introducció de contaminacions que podrien conduir a resultats falsos positius o falsos negatius o fins i tot inhibir la reacció de la PCR. A més, les condicions de reacció han de ser el més idèntiques possible per a cada mostra individual dins d'una execució i també han de ser transferibles a reaccions posteriors (del mateix mètode). Això es refereix a la composició de les reaccions, així com al tipus de control de temperatura del ciclador. Per descomptat, s'han d'evitar en la mesura del possible els errors de l'usuari.
A continuació, demostrarem els reptes que es troben durant la preparació i al llarg de l'execució d'una PCR, i els enfocaments de solucions que existeixen pel que fa als instruments i consumibles utilitzats per a l'estandardització dels fluxos de treball de la PCR.
Preparació de la reacció
La dispensació de components de reacció en recipients de PCR, o plaques, respectivament, comporta múltiples reptes que s'han de superar:
Condicions de reacció
La dosificació exacta i precisa dels components individuals és indispensable quan es busca obtenir les condicions de reacció més idèntiques possibles. A més d'una bona tècnica de pipeteig, la selecció de l'eina adequada és fonamental. Les mescles mestres de PCR sovint contenen substàncies que augmenten la viscositat o generen escuma. Durant el procés de pipeteig, això provoca una humectació substancial de lapuntes de pipeta, cosa que redueix la precisió del pipeteig. L'ús de sistemes de dispensació directa o puntes de pipeta alternatives que són menys propenses a mullar-se pot millorar la precisió i la precisió del procés de pipeteig.
Contaminacions
Durant el procés de dispensació, es generen aerosols que, si es permeten que arribin a l'interior de la pipeta, poden contaminar una altra mostra durant el següent pas de pipeteig. Això es pot evitar mitjançant l'ús de filtres o sistemes de desplaçament directe.
Consumibles com araconsellsEls recipients i les plaques que s'utilitzen en el flux de treball de la PCR no han de contenir substàncies que comprometin la mostra o falsegin el resultat. Aquestes inclouen ADN, DNases, RNases i inhibidors de la PCR, així com components que es puguin filtrar del material durant la reacció: substàncies conegudes com a lixiviables.
Error d'usuari
Com més mostres es processin, més alt serà el risc d'error. Pot passar fàcilment que una mostra es pipetegi al recipient o al pou equivocat. Aquest risc es pot reduir considerablement mitjançant un marcatge fàcilment discernible dels pous. Mitjançant l'automatització dels passos de dispensació, es minimitza el "factor humà", és a dir, els errors i les variacions relacionades amb l'usuari, augmentant així la reproductibilitat, especialment en el cas de volums de reacció petits. Això requereix plaques amb una estabilitat dimensional suficient per ser utilitzades en una estació de treball. Els codis de barres adjunts proporcionen una llegibilitat addicional per màquina, cosa que simplifica el seguiment de la mostra durant tot el procés.
Programació del termociclador
Programar un instrument pot resultar lent i propens a errors. Diferents funcions del termociclador de PCR treballen conjuntament per simplificar aquest pas del procés i, el més important, per fer-lo segur:
Un funcionament fàcil i una bona guia per a l'usuari són la base d'una programació eficient. Sobre aquesta base, l'administració d'usuaris protegida amb contrasenya evitarà que altres usuaris modifiquin els propis programes. Si s'utilitzen diversos cicladors (del mateix tipus), és beneficiós que un programa es pugui transferir directament d'un instrument a un altre mitjançant USB o connectivitat. El programari informàtic permet l'administració centralitzada i segura dels programes, els drets d'usuari i els documents en un ordinador.
Execució de PCR
Durant l'execució, l'ADN s'amplifica al recipient de reacció, on cada mostra s'ha de sotmetre a condicions de reacció idèntiques i consistents. Els aspectes següents són rellevants per al procés:
Control de temperatura
L'excel·lent precisió en el control de la temperatura i l'homogeneïtat del bloc ciclador són la base per a un condicionament uniforme de la temperatura de totes les mostres. L'alta qualitat dels elements de calefacció i refrigeració (elements Peltier), així com la manera com estan connectats al bloc, són els factors decisius que determinaran el risc de discrepàncies de temperatura conegudes com a "efecte vora".
Evaporació
Les concentracions dels components individuals de la reacció no haurien de canviar al llarg de la reacció a causa de l'evaporació. En cas contrari, és possible que molt pocproducte de PCRes pot generar, o cap en absolut. Per tant, és crucial minimitzar l'evaporació assegurant un segellat segur. En aquest cas, la tapa escalfada del termociclador i el segellat del recipient treballen conjuntament. Hi ha diferents opcions de segellat disponibles per aPlaques de PCR (enllaç: Article sobre segellat), de manera que el millor segellat s'aconsegueix mitjançant el segellat per calor. Altres tancaments també poden ser adequats, sempre que la pressió de contacte de la tapa del ciclador es pugui ajustar al segellat seleccionat.
L'estandardització dels processos està implementada per tal de salvaguardar resultats precisos i reproduïbles a llarg termini. Això inclou el manteniment regular de l'equip per garantir que sempre estigui en bon estat de funcionament. Tots els consumibles han de ser d'una qualitat constantment alta en tots els lots produïts i s'ha de garantir la seva disponibilitat fiable.
Data de publicació: 29 de novembre de 2022