Standardizacija procesa uključuje njihovu optimizaciju i naknadno uspostavljanje i harmonizaciju, omogućavajući dugoročne optimalne performanse – nezavisno od korisnika. Standardizacija osigurava visokokvalitetne rezultate, kao i njihovu ponovljivost i uporedivost.
Cilj (klasične) PCR analize je dobijanje pouzdanog i reproducibilnog rezultata. Za određene primjene, prinosPCR produktje također relevantno. Za ove reakcije, mora se voditi računa da se osigura da uzorci nisu ugroženi i da PCR tijek rada ostane stabilan. Konkretno, ovo se prevodi u minimiziranje unošenja kontaminacija koje bi mogle dovesti do lažno pozitivnih ili lažno negativnih rezultata ili čak inhibirati PCR reakciju. Nadalje, uvjeti reakcije trebaju biti što identičniji za svaki pojedinačni uzorak unutar jednog ciklusa i također prenosivi na sljedeće reakcije (iste metode). To se odnosi na sastav reakcija, kao i na vrstu kontrole temperature u cikleru. Naravno, greške korisnika treba izbjegavati koliko god je to moguće.
U nastavku ćemo prikazati izazove koji se javljaju tokom pripreme i izvođenja PCR analize – i pristupe rješenjima koja postoje u pogledu instrumenata i potrošnog materijala koji se koriste za standardizaciju PCR radnih procesa.
Priprema reakcije
Distribucija reakcijskih komponenti u PCR posude, odnosno ploče, uključuje više izazova koje treba savladati:
Reakcijski uslovi
Precizno i tačno doziranje pojedinačnih komponenti je neophodno kada se teže što identičnijim reakcijskim uslovima. Pored dobre tehnike pipetiranja, ključan je i odabir pravog alata. PCR master-miksevi često sadrže supstance koje povećavaju viskoznost ili stvaraju pjenu. Tokom procesa pipetiranja, to dovodi do značajnog vlaženja...vrhovi pipeta, čime se smanjuje tačnost pipetiranja. Upotreba sistema za direktno doziranje ili alternativnih vrhova pipeta koji su manje skloni vlaženju može poboljšati tačnost i preciznost procesa pipetiranja.
Kontaminacije
Tokom procesa doziranja, stvaraju se aerosoli koji, ako im se dozvoli da dospiju u unutrašnjost pipete, mogu potencijalno kontaminirati drugi uzorak tokom sljedećeg koraka pipetiranja. To se može spriječiti korištenjem filter vrhova ili sistema direktnog istiskivanja.
Potrošni materijal kao što susavjetiPosude i ploče koje se koriste u PCR postupku ne smiju sadržavati tvari koje ugrožavaju uzorak ili krivotvore rezultat. To uključuje DNK, DNaze, RNaze i PCR inhibitore, kao i komponente koje se potencijalno mogu isprazniti iz materijala tokom reakcije – tvari poznate kao ispirajuće tvari.
Greška korisnika
Što se više uzoraka obrađuje, to je veći rizik od greške. Lako se može dogoditi da se uzorak pipetira u pogrešnu posudu ili pogrešnu posudu. Ovaj rizik se može znatno smanjiti lako uočljivim označavanjem posuda. Automatizacijom koraka doziranja, "ljudski faktor", tj. greške i varijacije povezane s korisnikom, minimiziraju se, čime se povećava ponovljivost, posebno u slučaju malih reakcijskih volumena. To zahtijeva ploče dovoljne dimenzionalne stabilnosti koje se mogu koristiti u radnoj stanici. Priloženi barkodovi pružaju dodatnu mašinsku čitljivost, što pojednostavljuje praćenje uzorka tokom cijelog procesa.
Programiranje termociklera
Programiranje instrumenta može biti dugotrajno, kao i podložno greškama. Različite karakteristike PCR termociklera rade zajedno kako bi pojednostavile ovaj korak procesa i, što je najvažnije, učinile ga sigurnim:
Jednostavno rukovanje i dobro korisničko uputstvo su osnova efikasnog programiranja. Nadovezujući se na ovu osnovu, administracija korisnika zaštićena lozinkom spriječit će da drugi korisnici mijenjaju vlastite programe. Ako se koristi više ciklera (istog tipa), korisno je ako se program može direktno prenijeti s jednog instrumenta na drugi putem USB-a ili povezivanja. Računarski softver omogućava centralnu i sigurnu administraciju programa, korisničkih prava i dokumenata na računaru.
PCR analiza
Tokom analize, DNK se amplificira u reakcijskoj posudi, gdje svaki uzorak treba biti podvrgnut identičnim, konzistentnim reakcijskim uslovima. Sljedeći aspekti su relevantni za proces:
Kontrola temperature
Odlična tačnost u kontroli temperature i homogenost bloka ciklera su osnova za ravnomjerno temperaturno kondicioniranje svih uzoraka. Visok kvalitet elemenata za grijanje i hlađenje (Peltierovi elementi), kao i način na koji su povezani sa blokom, odlučujući su faktori koji će odrediti rizik od temperaturnih odstupanja poznatih kao "efekat ivice".
Isparavanje
Koncentracije pojedinačnih reakcijskih komponenti ne bi se trebale mijenjati tokom reakcije zbog isparavanja. U suprotnom, moguće je da se vrlo maloPCR produktmože se generirati ili se uopće ne generira. Stoga je ključno smanjiti isparavanje osiguravanjem sigurnog zatvaranja. U ovom slučaju, zagrijani poklopac termociklera i zatvarač posude rade ruku pod ruku. Dostupne su različite opcije zatvaranja zaPCR ploče (link: Članak o zatvaranju), pri čemu se najbolje zaptivanje postiže termičkim zaptivanjem. Drugi zatvarači također mogu biti prikladni, sve dok se kontaktni pritisak poklopca ciklera može prilagoditi odabranom zaptivaču.
Standardizacija procesa je na snazi kako bi se dugoročno osigurali tačni i ponovljivi rezultati. To uključuje redovno održavanje opreme kako bi se osiguralo da je uvijek u dobrom radnom stanju. Sav potrošni materijal treba biti dosljedno visokog kvaliteta u svim proizvedenim serijama, a njihova pouzdana dostupnost mora biti zagarantovana.
Vrijeme objave: 29. novembar 2022.