يشمل توحيد العمليات تحسينها، ثم إنشائها ومواءمتها، مما يسمح بتحقيق أداء مثالي على المدى الطويل، بغض النظر عن المستخدم. ويضمن التوحيد نتائج عالية الجودة، بالإضافة إلى إمكانية تكرارها ومقارنتها.
الهدف من تفاعل البوليميراز المتسلسل (التقليدي) هو الحصول على نتيجة موثوقة وقابلة للتكرار. في بعض التطبيقات، تكون نتاجمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسلهذا مهم أيضًا. في هذه التفاعلات، يجب توخي الحذر لضمان عدم تضرر العينات واستقرار سير عمل تفاعل البوليميراز المتسلسل. ويعني هذا تحديدًا تقليل التلوث الذي قد يؤدي إلى نتائج إيجابية أو سلبية خاطئة أو حتى تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل. علاوة على ذلك، يجب أن تكون ظروف التفاعل متطابقة قدر الإمكان لكل عينة على حدة ضمن كل دورة، وأن تكون قابلة للتطبيق على التفاعلات اللاحقة (بنفس الطريقة). ويتعلق هذا بتركيبة التفاعلات ونوع التحكم في درجة الحرارة في جهاز التدوير. وبالطبع، يجب تجنب أخطاء المستخدم قدر الإمكان.
فيما يلي، سنوضح التحديات التي نواجهها أثناء التحضير وخلال تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل - والنهج المتاحة للحلول فيما يتعلق بالأدوات والمواد الاستهلاكية المستخدمة لتوحيد سير عمل تفاعل البوليميراز المتسلسل.
تحضير التفاعل
يتضمن توزيع مكونات التفاعل في أوعية تفاعل البوليميراز المتسلسل، أو الألواح، على التوالي، تحديات متعددة يجب التغلب عليها:
ظروف التفاعل
يُعدّ تحديد الجرعات الدقيقة والدقيقة للمكونات الفردية أمرًا بالغ الأهمية عند السعي لتحقيق أفضل ظروف تفاعل ممكنة. بالإضافة إلى تقنية سحب جيدة، يُعدّ اختيار الأداة المناسبة أمرًا بالغ الأهمية. غالبًا ما تحتوي مخاليط تفاعل البوليميراز المتسلسل الرئيسية على مواد تزيد اللزوجة أو تُولّد رغوة. أثناء عملية السحب، تؤدي هذه المواد إلى تبليل كبير للعينة.أطراف الماصةمما يقلل من دقة سحب العينة. استخدام أنظمة التوزيع المباشر أو رؤوس ماصة بديلة أقل عرضة للبلل يُحسّن دقة عملية سحب العينة.
التلوثات
أثناء عملية التوزيع، تتولد جزيئات رذاذ، وإذا سُمح لها بالوصول إلى داخل الماصة، فقد تُلوث عينة أخرى خلال خطوة التقطير التالية. يمكن منع ذلك باستخدام رؤوس ترشيح أو أنظمة إزاحة مباشرة.
المواد الاستهلاكية مثلنصائحيجب ألا تحتوي الأوعية والصفائح المستخدمة في سير عمل تفاعل البوليميراز المتسلسل على مواد تُضرّ بالعينة أو تُشوّه النتيجة. وتشمل هذه المواد مُثبطات الحمض النووي (DNA)، وإنزيمات الدناز (DNases)، والرنا (RNases)، ومُثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل، بالإضافة إلى مُكونات قد تتسرب من المادة أثناء التفاعل، وتُعرف باسم المواد القابلة للتسرب.
خطأ المستخدم
كلما زادت عدد العينات المُعالَجة، زاد خطر الخطأ. من السهل أن تُضخّ عينة في وعاء أو بئر غير مناسب. يمكن تقليل هذا الخطر بشكل كبير من خلال وضع علامات واضحة على الآبار. من خلال أتمتة خطوات التوزيع، يتم تقليل "العامل البشري"، أي الأخطاء والاختلافات المتعلقة بالمستخدم، مما يزيد من إمكانية إعادة الإنتاج، خاصةً في حالات أحجام التفاعل الصغيرة. يتطلب هذا استخدام ألواح ذات ثبات أبعاد كافٍ في محطة العمل. توفر الباركودات المرفقة سهولة قراءة آلية إضافية، مما يُبسّط تتبع العينات طوال العملية بأكملها.
برمجة جهاز التدوير الحراري
قد تكون برمجة جهاز ما مُستهلكة للوقت ومُعرّضة للأخطاء. تعمل ميزات مُختلفة لجهاز التدوير الحراري لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) معًا لتبسيط هذه الخطوة من العملية، والأهم من ذلك، لجعلها آمنة:
سهولة التشغيل وحسن توجيه المستخدم هما أساس البرمجة الفعّالة. وبناءً على هذا الأساس، فإن إدارة المستخدم المحمية بكلمة مرور ستمنع تعديل برامج المستخدم من قِبل مستخدمين آخرين. في حال استخدام عدة أجهزة دائرية (من نفس النوع)، يُفضّل نقل البرنامج مباشرةً من جهاز إلى آخر عبر منفذ USB أو منافذ التوصيل. تُتيح برامج الحاسوب إدارة مركزية وآمنة للبرامج وحقوق المستخدمين والمستندات على جهاز الحاسوب.
تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل
أثناء التشغيل، يُضخَّم الحمض النووي في وعاء التفاعل، حيث يجب أن تخضع كل عينة لظروف تفاعل متطابقة ومتسقة. الجوانب التالية مهمة لهذه العملية:
التحكم في درجة الحرارة
الدقة الممتازة في التحكم في درجة الحرارة وتجانس كتلة المُدَوِّر هما أساس التكييف الحراري المتساوي لجميع العينات. الجودة العالية لعناصر التسخين والتبريد (عناصر بيلتييه)، بالإضافة إلى طريقة توصيلها بالكتلة، هما العاملان الحاسمان اللذان يُحدِّدان خطر اختلافات درجة الحرارة المعروفة باسم "تأثير الحافة".
تبخر
يجب ألا تتغير تركيزات مكونات التفاعل الفردية أثناء التفاعل بسبب التبخر. وإلا، فمن الممكن أن يكون هناك القليل جدًا منمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسلقد يتولد بخار، أو لا يتولد على الإطلاق. لذلك، من الضروري تقليل التبخر بضمان إغلاق محكم. في هذه الحالة، يعمل غطاء جهاز التدوير الحراري المُدفأ وختم الوعاء جنبًا إلى جنب. تتوفر خيارات إغلاق مختلفة لـألواح تفاعل البوليميراز المتسلسل (الرابط: مقالة الختم)حيث يتم تحقيق أفضل إحكام من خلال العزل الحراري. قد تكون هناك أيضًا أنواع أخرى من الإغلاقات المناسبة، طالما يُمكن ضبط ضغط تلامس غطاء جهاز التدوير بما يتناسب مع الإحكام المُختار.
تم وضع معايير موحدة للعمليات لضمان دقة النتائج وقابليتها للتكرار على المدى الطويل. ويشمل ذلك الصيانة الدورية للمعدات لضمان عملها بشكل جيد دائمًا. يجب أن تكون جميع المواد الاستهلاكية عالية الجودة باستمرار في جميع الدفعات المنتجة، ويجب ضمان توفرها بشكل موثوق.
وقت النشر: ٢٩ نوفمبر ٢٠٢٢