Die standaardisering van prosesse sluit die optimalisering en daaropvolgende vestiging en harmonisering daarvan in, wat langtermyn optimale prestasie moontlik maak – onafhanklik van die gebruiker. Standaardisering verseker hoëgehalte-resultate, sowel as die reproduceerbaarheid en vergelykbaarheid daarvan.
Die doel van (klassieke) PCR is die generering van 'n betroubare en reproduceerbare resultaat. Vir sekere toepassings is die opbrengs van diePCR-produkis ook relevant. Vir hierdie reaksies moet sorg gedra word dat monsters nie gekompromitteer word nie en dat die PCR-werkvloei stabiel bly. Spesifiek beteken dit dat die bekendstelling van kontaminasies wat tot vals positiewe of vals negatiewe resultate kan lei of selfs die PCR-reaksie kan inhibeer, geminimaliseer word. Verder moet die reaksiekondisies so identies as moontlik wees vir elke individuele monster binne 'n lopie en ook oordraagbaar wees na daaropvolgende reaksies (van dieselfde metode). Dit verwys na die samestelling van die reaksies sowel as die tipe temperatuurbeheer in die sikleerder. Gebruikersfoute moet natuurlik soveel as moontlik vermy word.
Hieronder sal ons die uitdagings demonstreer wat tydens die voorbereiding en deur die loop van 'n PCR ondervind word – en die benaderings tot oplossings wat bestaan met betrekking tot instrumente en verbruiksgoedere wat gebruik word vir die standaardisering van die PCR-werkvloei.
Reaksievoorbereiding
Die toediening van reaksiekomponente in PCR-vate, of plate, onderskeidelik, behels verskeie uitdagings wat oorkom moet word:
Reaksiekondisies
Die presiese en presiese dosering van die individuele komponente is onontbeerlik wanneer daar na die mees identiese reaksietoestande gestreef word. Benewens 'n goeie pipetteringstegniek, is die keuse van die regte gereedskap krities. PCR-meestermengsels bevat dikwels stowwe wat die viskositeit verhoog of skuim genereer. Tydens die pipetteringsproses lei dit tot aansienlike benatting van diepipetpunte, wat die akkuraatheid van pipettering verminder. Die gebruik van direkte doseerstelsels of alternatiewe pipetpunte wat minder geneig is tot benatting, kan die akkuraatheid en presisie van die pipetteerproses verbeter.
Besoedeling
Tydens die doseerproses word aërosole gegenereer wat, indien dit die binnekant van die pipet bereik, moontlik 'n ander monster tydens die volgende pipetteringsstap kan besoedel. Dit kan voorkom word deur filterpunte of direkte verplasingstelsels te gebruik.
Verbruikbare goedere sooswenke, vate en plate wat in die PCR-werkvloei gebruik word, mag nie stowwe bevat wat die monster benadeel of die resultaat vervals nie. Dit sluit in DNS, DNases, RNases en PCR-inhibeerders, sowel as komponente wat moontlik tydens die reaksie uit die materiaal kan loog – stowwe wat bekend staan as loogbare stowwe.
Gebruikersfout
Hoe meer monsters verwerk word, hoe hoër is die foutrisiko. Dit kan maklik gebeur dat 'n monster in die verkeerde houer of die verkeerde putjie gepipetteer word. Hierdie risiko kan aansienlik verminder word deur maklik onderskeibare merk van die putjies. Deur die outomatisering van doseerstappe word die "menslike faktor", d.w.s. foute en gebruikersverwante variasies, geminimaliseer, wat die reproduceerbaarheid verhoog, veral in die geval van klein reaksievolumes. Dit vereis dat plate met voldoende dimensionele stabiliteit in 'n werkstasie gebruik word. Aangehegte strepieskodes bied addisionele masjienleesbaarheid, wat monsteropsporing deur die hele proses vereenvoudig.
Programmering van die termosikleerder
Die programmering van 'n instrument kan tydrowend sowel as foutgevoelig wees. Verskillende PCR-termiese sikleerderkenmerke werk saam om hierdie prosesstap te vereenvoudig en, bowenal, om dit veilig te maak:
Maklike werking en goeie gebruikersleiding is die basis van doeltreffende programmering. Deur op hierdie fondament voort te bou, sal wagwoordbeskermde gebruikersadministrasie verhoed dat 'n mens se eie programme deur ander gebruikers verander word. Indien verskeie siklusmasjiene (van dieselfde tipe) in gebruik is, is dit voordelig as 'n program direk van een instrument na 'n ander oorgedra kan word via USB of konnektiwiteit. Rekenaarsagteware maak sentrale en veilige administrasie van programme, gebruikersregte en dokumente op 'n rekenaar moontlik.
PCR-lopie
Tydens die lopie word DNA in die reaksievat geamplifiseer, waar elke monster aan identiese, konsekwente reaksiekondisies onderwerp moet word. Die volgende aspekte is relevant vir die proses:
Temperatuurbeheer
Uitstekende akkuraatheid in temperatuurbeheer en homogeniteit van die siklusblok is die basis vir egalige temperatuurkondisionering van alle monsters. Die hoë gehalte van die verhittings- en verkoelingselemente (peltier-elemente), sowel as die manier waarop hierdie aan die blok gekoppel is, is die beslissende faktore wat die risiko van temperatuurverskille, bekend as die "rand-effek", sal bepaal.
Verdamping
Die konsentrasies van die individuele reaksiekomponente behoort nie gedurende die verloop van die reaksie as gevolg van verdamping te verander nie. Andersins is dit moontlik dat baie minPCR-produkmag gegenereer word, of glad nie. Dit is dus van kardinale belang om verdamping te verminder deur 'n veilige seël te verseker. In hierdie geval werk die verhitte deksel van die termosikleerder en die seël van die houer hand aan hand. Verskillende seëlopsies is beskikbaar virPCR-plate (skakel: Verseëlingsartikel), waardeur die beste seël deur hitteverseëling verkry word. Ander sluitings kan ook geskik wees, solank die kontakdruk van die siklusdeksel aangepas kan word by die gekose seël.
Prosesstandaardisering is in plek om akkurate en reproduceerbare resultate op die lang termyn te verseker. Dit sluit gereelde onderhoud van die toerusting in om te verseker dat dit altyd in 'n goeie werkende toestand is. Alle verbruiksgoedere moet van konsekwent hoë gehalte wees in alle vervaardigde lotte, en hul betroubare beskikbaarheid moet gewaarborg word.
Plasingstyd: 29 Nov 2022