Hyrje
Çfarë është nxjerrja e acidit nukleik?
Në terma shumë të thjeshtë, nxjerrja e acidit nukleik është heqja e ARN-së dhe/ose ADN-së nga një mostër dhe e gjithë tepricës së panevojshme. Procesi i nxjerrjes izolon acidet nukleike nga një mostër dhe i jep ato në formën e një eluati të koncentruar, pa hollues dhe ndotës që mund të ndikojnë në çdo aplikim pasues.
Zbatimet e Nxjerrjes së Acidit Nukleik
Acidet nukleike të pastruara përdoren në një mori aplikimesh të ndryshme, duke filluar në industri të shumta. Kujdesi shëndetësor është ndoshta fusha ku përdoren më shumë, me ARN dhe ADN të pastruar të nevojshme për një mori qëllimesh të ndryshme testimi.
Zbatimet e nxjerrjes së acidit nukleik në kujdesin shëndetësor përfshijnë:
- Sekuencimi i Gjeneratës së Ardhshme (NGS)
- Gjenotipizimi i SNP-së bazuar në amplifikim
- Gjenotipizimi i bazuar në vargje
- Tretja me enzimë kufizuese
- Analiza duke përdorur enzima modifikuese (p.sh. Lidhja dhe klonimi)
Ekzistojnë edhe fusha të tjera përtej kujdesit shëndetësor ku përdoret nxjerrja e acidit nukleik, duke përfshirë, por pa u kufizuar në testimin e atësisë, mjekësinë ligjore dhe gjenomikën.
Një histori e shkurtër e nxjerrjes së acidit nukleik
Nxjerrja e ADN-sëDaton shumë kohë më parë, me izolimin e parë të njohur që është kryer nga një mjek zviceran i quajtur Friedrich Miescher në vitin 1869. Miescher shpresonte të zgjidhte parimet themelore të jetës duke përcaktuar përbërjen kimike të qelizave. Pasi dështoi me limfocitet, ai arriti të merrte një precipitat të papërpunuar të ADN-së nga leukocitet e gjetura në qelb në fashot e hedhura. Ai e bëri këtë duke shtuar acid dhe më pas alkalin në qelizë për të dalë nga citoplazma e qelizës, dhe më pas zhvilloi një protokoll për të ndarë ADN-në nga proteinat e tjera.
Pas hulumtimit inovativ të Miescher, shumë shkencëtarë të tjerë kanë vazhduar të përparojnë dhe zhvillojnë teknika për të izoluar dhe pastruar ADN-në. Edwin Joseph Cohn, një shkencëtar i proteinave, zhvilloi shumë teknika për pastrimin e proteinave gjatë Luftës së Dytë Botërore. Ai ishte përgjegjës për izolimin e fraksionit të albuminës së serumit të plazmës së gjakut, i cili është i rëndësishëm në ruajtjen e presionit osmotik në enët e gjakut. Kjo ishte thelbësore për mbajtjen gjallë të ushtarëve.
Në vitin 1953, Francis Crick, së bashku me Rosalind Franklin dhe James Watson, përcaktuan strukturën e ADN-së, duke treguar se ajo ishte e përbërë nga dy fije zinxhirësh të gjatë nukleotidesh të acidit nukleik. Ky zbulim i jashtëzakonshëm hapi rrugën për Meselson dhe Stahl, të cilët ishin në gjendje të zhvillonin një protokoll centrifugimi me gradient dendësie për të izoluar ADN-në nga bakteret E. Coli, ndërsa ata demonstruan replikimin gjysmë-konservues të ADN-së gjatë eksperimentit të tyre të vitit 1958.
Teknikat e Nxjerrjes së Acidit Nukleik
Cilat janë 4 fazat e nxjerrjes së ADN-së?
Të gjitha metodat e nxjerrjes përmblidhen në të njëjtat hapa themelorë.
Ndërprerja e qelizaveKjo fazë, e njohur edhe si lizë qelizore, përfshin zbërthimin e murit qelizor dhe/ose membranës qelizore, me qëllim çlirimin e lëngjeve intraqelizore që përmbajnë acidet nukleike të interesit.
Largimi i mbeturinave të padëshiruara. Kjo përfshin lipidet e membranës, proteinat dhe acide të tjera nukleike të padëshiruara të cilat mund të ndërhyjnë në aplikimet pasuese.
Izolimi. Ekzistojnë një numër mënyrash të ndryshme për të izoluar acidet nukleike të interesit nga lizatet e pastruara që keni krijuar, të cilat ndahen në dy kategori kryesore: në tretësirë ose në gjendje të ngurtë (shih seksionin tjetër).
Përqendrimi. Pasi acidet nukleike janë izoluar nga të gjithë ndotësit dhe holluesit e tjerë, ato paraqiten në një eluat me përqendrim të lartë.
Dy Llojet e Nxjerrjes
Ekzistojnë dy lloje të nxjerrjes së acidit nukleik - metodat e bazuara në tretësirë dhe metodat në gjendje të ngurtë. Metoda e bazuar në tretësirë njihet edhe si metoda e nxjerrjes kimike, pasi përfshin përdorimin e kimikateve për të zbërthyer qelizën dhe për të aksesuar materialin nukleik. Kjo mund të jetë duke përdorur ose komponime organike si fenoli dhe kloroformi, ose komponime inorganike më pak të dëmshme dhe për këtë arsye më të rekomanduara si Proteinaza K ose xheli i silicës.
Shembuj të metodave të ndryshme të nxjerrjes kimike për të zbërthyer një qelizë përfshijnë:
- Këputja osmotike e membranës
- Tretja enzimatike e murit qelizor
- Tretësira e membranës
- Me detergjentë
- Me trajtim alkali
Teknikat e gjendjes së ngurtë, të njohura edhe si metoda mekanike, përfshijnë shfrytëzimin e mënyrës se si ADN-ja bashkëvepron me një substrat të ngurtë. Duke zgjedhur një sferë ose molekulë me të cilën do të lidhet ADN-ja, por analiti jo, është e mundur të ndahen të dyja. Shembuj të teknikave të nxjerrjes në fazë të ngurtë përfshijnë përdorimin e silicës dhe sferave magnetike.
Nxjerrja e Rruazave Magnetike e Shpjeguar
Metoda e Nxjerrjes së Rruazave Magnetike
Potenciali për nxjerrje duke përdorur sfera magnetike u njoh për herë të parë në një patentë amerikane të paraqitur nga Trevor Hawkins, për institucionin kërkimor të Institutit Whitehead. Kjo patentë pranoi se ishte e mundur të nxirrej materiali gjenetik duke i lidhur ato me një bartës mbështetës të ngurtë, i cili mund të jetë një sferë magnetike. Parimi është që ju përdorni një sferë magnetike shumë të funksionalizuar mbi të cilën do të lidhet materiali gjenetik, i cili më pas mund të ndahet nga supernatanti duke aplikuar një forcë magnetike në pjesën e jashtme të enës që mban mostrën.
Pse të përdoret nxjerrja me sfera magnetike?
Teknologjia e nxjerrjes së sferave magnetike po bëhet gjithnjë e më e përhapur, për shkak të potencialit që ajo mbart për procedura të shpejta dhe efikase të nxjerrjes. Kohët e fundit ka pasur zhvillime të sferave magnetike shumë të funksionalizuara me sisteme të përshtatshme tamponi, të cilat kanë bërë të mundur automatizimin e nxjerrjes së acidit nukleik dhe një rrjedhë pune që është shumë e lehtë në burime dhe me kosto efikase. Gjithashtu, metodat e nxjerrjes së sferave magnetike nuk përfshijnë hapat e centrifugimit që mund të shkaktojnë forca prerëse të cilat copëtojnë copa më të gjata të ADN-së. Kjo do të thotë që fijet më të gjata të ADN-së mbeten të paprekura, gjë që është e rëndësishme në testimin gjenomik.
Koha e postimit: 25 nëntor 2022