การสกัดกรดนิวคลีอิกและวิธีเม็ดแม่เหล็ก

การแนะนำ

การสกัดกรดนิวคลีอิกคืออะไร?

ในแง่ที่ง่ายที่สุด การสกัดกรดนิวคลีอิกคือการกำจัด RNA และ/หรือ DNA ออกจากตัวอย่างและส่วนเกินทั้งหมดที่ไม่จำเป็นกระบวนการสกัดจะแยกกรดนิวคลีอิกออกจากตัวอย่างและให้ผลลัพธ์ในรูปของสารชะล้างเข้มข้น ปราศจากสารเจือจางและสิ่งปนเปื้อนที่อาจส่งผลกระทบต่อการใช้งานขั้นปลายน้ำ

การประยุกต์ใช้การสกัดกรดนิวคลีอิก

กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์ถูกนำมาใช้ในการใช้งานต่างๆ มากมาย ในอุตสาหกรรมต่างๆ มากมายการดูแลสุขภาพอาจเป็นพื้นที่ที่มีการใช้งานมากที่สุด โดยมี RNA และ DNA บริสุทธิ์ที่จำเป็นสำหรับโฮสต์ที่มีวัตถุประสงค์ในการทดสอบที่แตกต่างกัน

การใช้งานของการสกัดกรดนิวคลีอิกในการดูแลสุขภาพ ได้แก่ :

- การขยาย PCR และ qPCR

- ลำดับรุ่นต่อไป (NGS)

- SNP Genotyping ที่ใช้การขยายสัญญาณ

- การสร้างจีโนไทป์แบบอาเรย์

- ข้อ จำกัด การย่อยเอนไซม์

- วิเคราะห์โดยใช้การปรับเปลี่ยนเอนไซม์ (เช่น Ligation และ Cloning)

ยังมีสาขาอื่นๆ นอกเหนือจากการดูแลสุขภาพที่ใช้การสกัดกรดนิวคลีอิก ซึ่งรวมถึงแต่ไม่จำกัดเพียงการทดสอบความเป็นพ่อ นิติเวช และจีโนมิกส์

ประวัติโดยย่อของการสกัดกรดนิวคลีอิก

การสกัดดีเอ็นเอย้อนกลับไปไกลมาก โดยมีแพทย์ชาวสวิสชื่อฟรีดริช มีเชอร์ทำการแยกตัวครั้งแรกในปี พ.ศ. 2412 Miescher หวังที่จะแก้ไขหลักการพื้นฐานของชีวิตด้วยการกำหนดองค์ประกอบทางเคมีของเซลล์หลังจากล้มเหลวกับลิมโฟไซต์ เขาก็สามารถรับตะกอน DNA หยาบๆ จากเม็ดเลือดขาวที่พบในหนองบนผ้าพันแผลที่ถูกทิ้งเขาทำสิ่งนี้โดยการเติมกรดและด่างเข้าไปในเซลล์เพื่อออกจากไซโตพลาสซึมของเซลล์ จากนั้นจึงพัฒนาวิธีปฏิบัติเพื่อแยก DNA ออกจากโปรตีนอื่นๆ

หลังจากการวิจัยอันล้ำสมัยของ Miescher นักวิทยาศาสตร์คนอื่นๆ จำนวนมากได้พัฒนาและพัฒนาเทคนิคในการแยกและทำให้ DNA บริสุทธิ์Edwin Joseph Cohn นักวิทยาศาสตร์ด้านโปรตีนได้พัฒนาเทคนิคมากมายในการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ในช่วงสงครามโลกครั้งที่ 2เขามีหน้าที่แยกส่วนซีรั่มอัลบูมินของพลาสมาในเลือด ซึ่งมีความสำคัญในการรักษาแรงดันออสโมติกในหลอดเลือดนี่เป็นสิ่งสำคัญในการรักษาทหารให้มีชีวิตอยู่

ในปี 1953 ฟรานซิส คริก พร้อมด้วยโรซาลินด์ แฟรงคลิน และเจมส์ วัตสัน ได้กำหนดโครงสร้างของดีเอ็นเอ โดยแสดงให้เห็นว่า DNA ประกอบด้วยสายโซ่ยาวสองเส้นของนิวคลีโอไทด์ของกรดนิวคลีอิกการค้นพบที่ก้าวล้ำนี้ปูทางให้ Meselson และ Stahl ซึ่งสามารถพัฒนาโปรโตคอลการปั่นแยกด้วยเกรเดียนต์ของความหนาแน่นเพื่อแยก DNA ออกจากแบคทีเรีย E. Coli ในขณะที่พวกเขาสาธิตการจำลองแบบกึ่งอนุรักษ์ของ DNA ในระหว่างการทดลองในปี 1958

เทคนิคการสกัดกรดนิวคลีอิก

การสกัด DNA มี 4 ขั้นตอนอะไรบ้าง?
วิธีการสกัดทั้งหมดมีขั้นตอนพื้นฐานเดียวกัน

การหยุดชะงักของเซลล์.ระยะนี้หรือที่เรียกว่าการสลายเซลล์ เกี่ยวข้องกับการทำลายผนังเซลล์และ/หรือเยื่อหุ้มเซลล์ เพื่อปล่อยของเหลวภายในเซลล์ที่มีกรดนิวคลีอิกที่น่าสนใจ

การกำจัดเศษที่ไม่พึงประสงค์ซึ่งรวมถึงไขมันของเมมเบรน โปรตีน และกรดนิวคลีอิกที่ไม่ต้องการอื่นๆ ซึ่งอาจรบกวนการใช้งานขั้นปลายน้ำ

การแยกตัว.มีหลายวิธีในการแยกกรดนิวคลีอิกที่สนใจออกจากไลซีนเคลียร์ที่คุณสร้างขึ้น ซึ่งอยู่ระหว่างสองประเภทหลัก: ที่เป็นสารละลายหรือสถานะของแข็ง (ดูหัวข้อถัดไป)

ความเข้มข้น.หลังจากที่กรดนิวคลีอิกถูกแยกออกจากสารปนเปื้อนและสารเจือจางอื่นๆ ทั้งหมดแล้ว กรดนิวคลีอิกจะถูกนำเสนอในสารชะล้างที่มีความเข้มข้นสูง

การสกัดสองประเภท
การสกัดกรดนิวคลีอิกมีสองประเภท – วิธีที่ใช้สารละลายและวิธีการโซลิดสเตตวิธีการที่ใช้สารละลายเรียกอีกอย่างว่าวิธีการสกัดด้วยสารเคมี เนื่องจากเกี่ยวข้องกับการใช้สารเคมีเพื่อสลายเซลล์และเข้าถึงวัสดุนิวคลีอิกโดยอาจใช้สารประกอบอินทรีย์ เช่น ฟีนอลและคลอโรฟอร์ม หรือสารประกอบอนินทรีย์ที่มีอันตรายน้อยกว่าและแนะนำมากกว่า เช่น โปรตีเนส K หรือซิลิกาเจล

ตัวอย่างวิธีการสกัดทางเคมีแบบต่างๆ เพื่อสลายเซลล์ ได้แก่:

- การแตกของเยื่อออสโมติก

- การย่อยด้วยเอนไซม์ของผนังเซลล์

- การละลายของเมมเบรน

- พร้อมผงซักฟอก

- ด้วยการบำบัดด้วยด่าง

เทคนิคโซลิดสเตตหรือที่เรียกว่าวิธีการเชิงกล เกี่ยวข้องกับการใช้ประโยชน์จากวิธีที่ DNA มีปฏิกิริยากับสารตั้งต้นที่เป็นของแข็งโดยการเลือกเม็ดบีดหรือโมเลกุลที่ DNA จะจับกันแต่ผู้วิเคราะห์จะไม่ทำ ก็เป็นไปได้ที่จะแยกทั้งสองออกจากกันตัวอย่างเทคนิคการสกัดแบบโซลิดเฟส รวมถึงการใช้ซิลิกาและเม็ดแม่เหล็ก

อธิบายการสกัดลูกปัดแม่เหล็ก

วิธีการสกัดลูกปัดแม่เหล็ก
ศักยภาพในการสกัดโดยใช้เม็ดแม่เหล็กได้รับการยอมรับครั้งแรกในสิทธิบัตรของสหรัฐฯ ที่ยื่นโดย Trevor Hawkins สำหรับสถาบันวิจัย Whitehead Instituteสิทธิบัตรนี้รับทราบว่ามีความเป็นไปได้ที่จะสกัดสารพันธุกรรมโดยการผูกเข้ากับตัวพาที่เป็นของแข็ง ซึ่งอาจเป็นเม็ดแม่เหล็กหลักการคือคุณใช้เม็ดบีดแม่เหล็กที่มีฟังก์ชันการทำงานสูง โดยที่สารพันธุกรรมจะเกาะติดกัน ซึ่งสามารถแยกออกจากส่วนเหนือตะกอนได้โดยใช้แรงแม่เหล็กที่ด้านนอกของภาชนะที่ถือตัวอย่าง

เหตุใดจึงต้องใช้การสกัดลูกปัดแม่เหล็ก
เทคโนโลยีการสกัดเม็ดบีดแม่เหล็กกำลังแพร่หลายมากขึ้น เนื่องจากมีศักยภาพสำหรับขั้นตอนการสกัดที่รวดเร็วและมีประสิทธิภาพในช่วงไม่กี่ครั้งที่ผ่านมา มีการพัฒนาเม็ดบีดแม่เหล็กที่มีฟังก์ชันการทำงานสูงพร้อมระบบบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม ซึ่งทำให้การสกัดกรดนิวคลีอิกเป็นอัตโนมัติและขั้นตอนการทำงานที่ใช้ทรัพยากรน้อยและคุ้มต้นทุนนอกจากนี้ วิธีการสกัดเม็ดบีดแม่เหล็กไม่เกี่ยวข้องกับขั้นตอนการปั่นเหวี่ยงที่อาจทำให้เกิดแรงเฉือนซึ่งทำให้ DNA ชิ้นที่ยาวกว่าแตกตัวได้ซึ่งหมายความว่าสาย DNA ที่ยาวกว่ายังคงไม่บุบสลาย ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญในการทดสอบจีโนมิกส์