Εισαγωγή
Τι είναι η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος;
Με τον απλούστερο όρο, η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος είναι η αφαίρεση του RNA και/ή του DNA από ένα δείγμα και όλης της περίσσειας που δεν είναι απαραίτητη.Η διαδικασία εκχύλισης απομονώνει τα νουκλεϊκά οξέα από ένα δείγμα και τα αποδίδει με τη μορφή συμπυκνωμένου εκλούσματος, απαλλαγμένου από αραιωτικά και μολυσματικά που θα μπορούσαν να επηρεάσουν τυχόν κατάντη εφαρμογές.
Εφαρμογές Εκχύλισης Νουκλεϊκού Οξέος
Τα καθαρισμένα νουκλεϊκά οξέα χρησιμοποιούνται σε μια πληθώρα διαφορετικών εφαρμογών, που κυμαίνονται σε πολλές διαφορετικές βιομηχανίες.Η υγειονομική περίθαλψη είναι ίσως ο τομέας όπου χρησιμοποιείται περισσότερο, με καθαρό RNA και DNA που απαιτούνται για πολλούς διαφορετικούς σκοπούς δοκιμών.
Οι εφαρμογές της εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος στην υγειονομική περίθαλψη περιλαμβάνουν:
- Αλληλουχία επόμενης γενιάς (NGS)
- Γονοτυποποίηση SNP με βάση την ενίσχυση
- Γονότυπος βάσει πίνακα
- Πέψη με ένζυμα περιορισμού
- Αναλύσεις με χρήση Τροποποιητικών Ενζύμων (π.χ. Σύνδεση και Κλωνοποίηση)
Υπάρχουν επίσης και άλλοι τομείς πέρα από την υγειονομική περίθαλψη όπου χρησιμοποιείται η εξαγωγή νουκλεϊκού οξέος, συμπεριλαμβανομένων, ενδεικτικά, των δοκιμών πατρότητας, της εγκληματολογίας και της γονιδιωματικής.
Μια σύντομη ιστορία της εκχύλισης νουκλεϊκών οξέων
Εξαγωγή DNAχρονολογείται από πολύ παλιά, με την πρώτη γνωστή απομόνωση να έχει πραγματοποιηθεί από έναν Ελβετό γιατρό ονόματι Friedrich Miescher το 1869. Ο Miescher ήλπιζε να λύσει τις θεμελιώδεις αρχές της ζωής προσδιορίζοντας τη χημική σύνθεση των κυττάρων.Αφού απέτυχε με τα λεμφοκύτταρα, μπόρεσε να λάβει ένα ακατέργαστο ίζημα DNA από λευκοκύτταρα που βρέθηκαν στο πύον σε πεταμένους επιδέσμους.Το έκανε αυτό προσθέτοντας οξύ και μετά αλκάλιο στο κύτταρο για να φύγει από το κυτταρόπλασμα του κυττάρου και στη συνέχεια ανέπτυξε ένα πρωτόκολλο για να διαχωρίσει το DNA από τις άλλες πρωτεΐνες.
Μετά την πρωτοποριακή έρευνα του Miescher, πολλοί άλλοι επιστήμονες έχουν προχωρήσει στην ανάπτυξη και ανάπτυξη τεχνικών για την απομόνωση και τον καθαρισμό του DNA.Ο Edwin Joseph Cohn, ένας επιστήμονας πρωτεϊνών ανέπτυξε πολλές τεχνικές για τον καθαρισμό των πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια του 2ου Παγκοσμίου Πολέμου.Ήταν υπεύθυνος για την απομόνωση του κλάσματος λευκωματίνης ορού του πλάσματος του αίματος, το οποίο είναι σημαντικό για τη διατήρηση της οσμωτικής πίεσης στα αιμοφόρα αγγεία.Αυτό ήταν κρίσιμο για τη διατήρηση των στρατιωτών στη ζωή.
Το 1953 ο Φράνσις Κρικ, μαζί με τη Ρόζαλιντ Φράνκλιν και τον Τζέιμς Γουάτσον, προσδιόρισαν τη δομή του DNA, δείχνοντας ότι αποτελούνταν από δύο κλώνους μακριών αλυσίδων νουκλεοτιδίων νουκλεϊκού οξέος.Αυτή η επαναστατική ανακάλυψη άνοιξε το δρόμο για τους Meselson και Stahl, οι οποίοι κατάφεραν να αναπτύξουν ένα πρωτόκολλο φυγοκέντρησης με κλίση πυκνότητας για να απομονώσουν DNA από βακτήρια E. Coli καθώς έδειξαν την ημι-συντηρητική αντιγραφή του DNA κατά το πείραμά τους το 1958.
Τεχνικές Εκχύλισης Νουκλεϊκού Οξέος
Ποια είναι τα 4 στάδια της εξαγωγής DNA;
Όλες οι μέθοδοι εξαγωγής συνοψίζονται στα ίδια βασικά βήματα.
Διαταραχή κυττάρων.Αυτό το στάδιο, γνωστό και ως κυτταρική λύση, περιλαμβάνει τη διάσπαση του κυτταρικού τοιχώματος και/ή της κυτταρικής μεμβράνης, προκειμένου να απελευθερωθούν τα ενδοκυτταρικά υγρά που περιέχουν τα νουκλεϊκά οξέα που μας ενδιαφέρουν.
Απομάκρυνση ανεπιθύμητων συντριμμιών.Αυτό περιλαμβάνει λιπίδια μεμβράνης, πρωτεΐνες και άλλα ανεπιθύμητα νουκλεϊκά οξέα που μπορούν να παρεμβαίνουν στις κατάντη εφαρμογές.
Απομόνωση.Υπάρχουν διάφοροι τρόποι για να απομονώσετε τα νουκλεϊκά οξέα που σας ενδιαφέρουν από το καθαρισμένο κυτταρόλυμα που δημιουργήσατε, οι οποίοι εμπίπτουν σε δύο κύριες κατηγορίες: με βάση το διάλυμα ή στερεά κατάσταση (βλ. επόμενη ενότητα).
Συγκέντρωση.Αφού απομονωθούν τα νουκλεϊκά οξέα από όλους τους άλλους μολυντές και αραιωτικά, παρουσιάζονται σε ένα εξαιρετικά συμπυκνωμένο έκλουσμα.
Τα δύο είδη εκχύλισης
Υπάρχουν δύο τύποι εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος – μέθοδοι που βασίζονται σε διάλυμα και μέθοδοι στερεάς κατάστασης.Η μέθοδος που βασίζεται σε διάλυμα είναι επίσης γνωστή ως μέθοδος χημικής εκχύλισης, καθώς περιλαμβάνει τη χρήση χημικών για τη διάσπαση του κυττάρου και την πρόσβαση στο νουκλεϊκό υλικό.Αυτό μπορεί να γίνει με τη χρήση είτε οργανικών ενώσεων όπως η φαινόλη και το χλωροφόρμιο, είτε οι λιγότερο επιβλαβείς και επομένως πιο συνιστώμενες ανόργανες ενώσεις όπως η πρωτεϊνάση Κ ή η γέλη πυριτίου.
Παραδείγματα διαφορετικών μεθόδων χημικής εκχύλισης για τη διάσπαση ενός κυττάρου περιλαμβάνουν:
- Οσμωτική ρήξη μεμβράνης
- Ενζυματική πέψη του κυτταρικού τοιχώματος
- Διαλυτοποίηση μεμβράνης
- Με απορρυπαντικά
- Με αλκαλική επεξεργασία
Οι τεχνικές στερεάς κατάστασης, επίσης γνωστές ως μηχανικές μέθοδοι, περιλαμβάνουν την εκμετάλλευση του τρόπου με τον οποίο το DNA αλληλεπιδρά με ένα στερεό υπόστρωμα.Επιλέγοντας ένα σφαιρίδιο ή ένα μόριο στο οποίο το DNA θα συνδεθεί αλλά ο αναλύτης όχι, είναι δυνατό να διαχωριστούν τα δύο.Παραδείγματα τεχνικών εκχύλισης στερεάς φάσης, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης πυριτίου και μαγνητικών σφαιριδίων.
Εξήγηση Μαγνητικής Χάντρας
Η Μέθοδος Εξαγωγής Μαγνητικής Χάντρας
Η δυνατότητα εξαγωγής με χρήση μαγνητικών σφαιριδίων αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά σε ένα δίπλωμα ευρεσιτεχνίας των ΗΠΑ που κατατέθηκε από τον Trevor Hawkins, για το ερευνητικό ίδρυμα του Ινστιτούτου Whitehead.Αυτό το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας αναγνώριζε ότι ήταν δυνατή η εξαγωγή γενετικού υλικού με τη δέσμευσή του σε έναν στερεό φορέα στήριξης, ο οποίος θα μπορούσε να είναι ένα μαγνητικό σφαιρίδιο.Η αρχή είναι ότι χρησιμοποιείτε ένα εξαιρετικά λειτουργικό μαγνητικό σφαιρίδιο πάνω στο οποίο θα συνδεθεί το γενετικό υλικό, το οποίο στη συνέχεια μπορεί να διαχωριστεί από το υπερκείμενο με την εφαρμογή μιας μαγνητικής δύναμης στο εξωτερικό του δοχείου που συγκρατεί το δείγμα.
Γιατί να χρησιμοποιήσετε την εξαγωγή μαγνητικού σφαιριδίου;
Η τεχνολογία εξαγωγής μαγνητικών σφαιριδίων γίνεται ολοένα και πιο διαδεδομένη, λόγω της δυνατότητας που διαθέτει για γρήγορες και αποτελεσματικές διαδικασίες εξαγωγής.Πρόσφατα, υπήρξαν εξελίξεις εξαιρετικά λειτουργικών μαγνητικών σφαιριδίων με κατάλληλα συστήματα ρυθμιστικού διαλύματος, τα οποία κατέστησαν δυνατή την αυτοματοποίηση της εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος και μια ροή εργασίας που είναι πολύ ελαφριά και οικονομικά αποδοτική.Επίσης, οι μέθοδοι εξαγωγής μαγνητικών σφαιριδίων δεν περιλαμβάνουν τα βήματα φυγοκέντρησης που μπορεί να προκαλέσουν δυνάμεις διάτμησης που διασπούν μακρύτερα κομμάτια DNA.Αυτό σημαίνει ότι μακρύτεροι κλώνοι DNA παραμένουν άθικτοι, κάτι που είναι σημαντικό στις γονιδιωματικές δοκιμές.
Ώρα δημοσίευσης: Νοε-25-2022