Estrazzjoni ta 'Aċidu Nuklejku u l-Metodu Xoffa Manjetika

Introduzzjoni

X'inhi l-Estrazzjoni tal-Aċidu Nukleiku?

Fl-iktar termini sempliċi, l-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku hija t-tneħħija tal-RNA u/jew DNA minn kampjun u l-eċċess kollu li mhux meħtieġ.Il-proċess ta' estrazzjoni jiżola l-aċidi nuklejċi minn kampjun u jagħtihom fil-forma ta' eluat konċentrat, ħieles minn dilwenti u kontaminanti li jistgħu jaffettwaw kwalunkwe applikazzjonijiet downstream.

Applikazzjonijiet ta' Estrazzjoni ta' Aċidu Nukleiku

L-aċidi nuklejċi purifikati jintużaw f'għadd kbir ta' applikazzjonijiet differenti, li jvarjaw f'diversi industriji differenti.Il-kura tas-saħħa hija forsi l-qasam fejn tintuża l-aktar, b’RNA u DNA purifikati meħtieġa għal għadd ta’ skopijiet ta’ ttestjar differenti.

L-applikazzjonijiet tal-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku fil-kura tas-saħħa jinkludu:

- Amplifikazzjoni tal-PCR u qPCR

- Sekwenzar tal-Ġenerazzjoni li Jmiss (NGS)

- SNP Genotyping ibbażat fuq l-amplifikazzjoni

- Ġenotipar ibbażat fuq Array

- Restrizzjoni Enżima Diġestjoni

- Analiżi bl-użu ta' Enżimi li Jmodifikaw (eż. Ligazzjoni u Klonazzjoni)

Hemm ukoll oqsma oħra lil hinn mill-kura tas-saħħa fejn tintuża l-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku, inklużi iżda mhux limitati għall-ittestjar tal-paternità, il-forensika u l-ġenomika.

Storja qasira ta 'estrazzjoni ta' Aċidu Nuklejku

Estrazzjoni tad-DNAjmur lura ħafna, bl-ewwel iżolament magħruf sar minn tabib Żvizzeru jismu Friedrich Miescher fl-1869. Miescher kien qed jittama li jsolvi l-prinċipji fundamentali tal-ħajja billi jiddetermina l-kompożizzjoni kimika taċ-ċelloli.Wara li falla bil-limfoċiti, huwa kien kapaċi jikseb preċipitat mhux raffinat ta 'DNA minn lewkoċiti misjuba fi timbotta fuq faxex mormija.Huwa għamel dan billi żied aċidu u mbagħad alkali maċ-ċellula biex iħalli ċ-ċitoplasma taċ-ċellula, u mbagħad żviluppa protokoll biex tissepara d-DNA mill-proteini l-oħra.

Wara r-riċerka innovattiva ta 'Miescher, ħafna xjenzati oħra komplew javvanzaw u żviluppaw tekniki biex jiżolaw u jippurifikaw id-DNA.Edwin Joseph Cohn, xjenzat tal-proteini żviluppa ħafna tekniki għall-purifikazzjoni tal-proteini matul it-Tieni WW2.Huwa kien responsabbli biex iżola l-frazzjoni tal-albumina tas-serum tal-plażma tad-demm, li hija importanti biex tinżamm il-pressjoni osmotika fil-vini tad-demm.Dan kien kruċjali biex is-suldati jinżammu ħajjin.

Fl-1953 Francis Crick, flimkien ma’ Rosalind Franklin u James Watson, iddeterminaw l-istruttura tad-DNA, u wera li kienet magħmula minn żewġ linji ta’ ktajjen twal ta’ nukleotidi ta’ aċidu nuklejku.Din l-iskoperta rivoluzzjonarja witta t-triq għal Meselson u Stahl, li setgħu jiżviluppaw protokoll ta’ ċentrifugazzjoni tal-gradjent tad-densità biex jiżolaw id-DNA minn batterji E. Coli hekk kif urew ir-replikazzjoni semi-konservattiva tad-DNA matul l-esperiment tagħhom tal-1958.

Tekniki ta' Estrazzjoni ta' Aċidu Nuklejku

X'inhuma l-4 stadji tal-estrazzjoni tad-DNA?
Il-metodi kollha ta 'estrazzjoni jitnaqqsu għall-istess passi fundamentali.

Tfixkil taċ-Ċelloli.Dan l-istadju, magħruf ukoll bħala liżi taċ-ċelluli, jinvolvi t-tkissir tal-ħajt taċ-ċellula u/jew il-membrana taċ-ċellula, sabiex jiġu rilaxxati l-fluwidi intra-ċellulari li fihom l-aċidi nuklejċi ta 'interess.

Tneħħija ta' Debris mhux mixtieqa.Dan jinkludi lipidi tal-membrana, proteini u aċidi nuklejċi oħra mhux mixtieqa li jistgħu jinterferixxu ma 'applikazzjonijiet downstream.

Iżolament.Hemm għadd ta' modi differenti biex tiżola l-aċidi nuklejċi ta' interess mil-lisat ikklerjat li ħloqt, li jaqgħu bejn żewġ kategoriji ewlenin: ibbażat fuq soluzzjoni jew stat solidu (ara t-taqsima li jmiss).

Konċentrazzjoni.Wara li l-aċidi nuklejċi jkunu ġew iżolati mill-kontaminanti u dilwenti l-oħra kollha, huma ppreżentati f'eluat ikkonċentrat ħafna.

Iż-żewġ tipi ta 'estrazzjoni
Hemm żewġ tipi ta 'estrazzjoni ta' aċidu nuklejku - metodi bbażati fuq soluzzjoni u metodi ta 'stat solidu.Il-metodu bbażat fuq is-soluzzjoni huwa magħruf ukoll bħala l-metodu ta 'estrazzjoni kimika, peress li jinvolvi l-użu ta' kimiċi biex ikissru ċ-ċellula u jaċċessaw il-materjal nuklejku.Dan jista 'jkun bl-użu jew komposti organiċi bħall-fenol u l-kloroform, jew il-komposti inorganiċi inqas ta' ħsara u għalhekk aktar rakkomandati bħal Proteinase K jew ġel tas-silika.

Eżempji ta’ metodi ta’ estrazzjoni kimika differenti biex tkisser ċellula jinkludu:

- Tkissir osmotiku tal-membrana

- Diġestjoni enżimatika tal-ħajt taċ-ċelluli

- Solubilizzazzjoni tal-membrana

- B'deterġenti

- Bi trattament alkali

Tekniki ta 'stat solidu, magħrufa wkoll bħala metodi mekkaniċi, jinvolvi l-isfruttament ta' kif id-DNA jinteraġixxi ma 'sottostrat solidu.Billi tagħżel xoffa jew molekula li d-DNA se jorbot fuqha iżda l-analite le, huwa possibbli li jiġu separati t-tnejn.Eżempji ta 'tekniki ta' estrazzjoni ta 'fażi solida inkluż l-użu tas-silika u żibeġ manjetiċi.

Estrazzjoni ta 'Xoffa Manjetika Spjegata

Il-Metodu ta' Estrazzjoni ta 'Xoffa Manjetika
Il-potenzjal għall-estrazzjoni bl-użu ta 'żibeġ manjetiċi ġie rikonoxxut l-ewwel fi privattiva Amerikana ppreżentata minn Trevor Hawkins, għall-istituzzjoni ta' riċerka tal-Whitehead Institute.Din il-privattiva rrikonoxxiet li kien possibbli li jiġi estratt materjal ġenetiku billi jorbot ma 'trasportatur ta' appoġġ solidu, li jista 'jkun xoffa manjetika.Il-prinċipju huwa li tuża xoffa manjetika funzjonalizzata ħafna li fuqha jingħaqad il-materjal ġenetiku, li mbagħad tista 'tiġi sseparata mis-supernatant billi tapplika forza manjetika fuq barra tar-reċipjent li jżomm il-kampjun.

Għaliex Uża Estrazzjoni ta 'Xoffa Manjetika?
It-teknoloġija ta 'estrazzjoni ta' żibeġ manjetiċi qed issir dejjem aktar prevalenti, minħabba l-potenzjal li għandha għal proċeduri ta 'estrazzjoni mgħaġġla u effiċjenti.Fi żminijiet reċenti kien hemm żviluppi ta 'żibeġ manjetiċi funzjonalizzati ħafna b'sistemi ta' buffer adattati, li għamlu possibbli l-awtomazzjoni tal-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku u fluss tax-xogħol li huwa ħafif ħafna fir-riżorsi u kosteffiċjenti.Ukoll, il-metodi ta 'estrazzjoni ta' żibeġ manjetiċi ma jinvolvux il-passi taċ-ċentrifugazzjoni li jistgħu jikkawżaw forzi ta 'shear li jkissru biċċiet itwal ta' DNA.Dan ifisser li linji itwal ta 'DNA jibqgħu intatti, li huwa importanti fl-ittestjar tal-ġenomika.