Inleiding
Wat is nukleïensuurekstraksie?
In die heel eenvoudigste terme is nukleïensuurekstraksie die verwydering van die RNA en/of DNA uit 'n monster en al die oormaat wat nie nodig is nie.Die proses van ekstraksie isoleer die nukleïensure uit 'n monster en lewer dit in die vorm van 'n gekonsentreerde eluaat, vry van verdunningsmiddels en kontaminante wat enige stroomaf toedienings kan beïnvloed.
Toepassings van nukleïensuurekstraksie
Gesuiwerde nukleïensure word in 'n oorvloed van verskillende toepassings gebruik, wat oor verskeie verskillende industrieë strek.Gesondheidsorg is miskien die area waar dit die meeste gebruik word, met gesuiwerde RNA en DNA wat vir 'n magdom verskillende toetsdoeleindes benodig word.
Toepassings van nukleïensuur-ekstraksie in gesondheidsorg sluit in:
- Volgende generasie volgordebepaling (NGS)
- Amplifikasie-gebaseerde SNP genotipering
- Skikking-gebaseerde genotipering
- Beperking Ensiemvertering
- Ontleed met behulp van Modifiserende Ensieme (bv. Ligering en Kloning)
Daar is ook ander velde buite gesondheidsorg waar nukleïensuur-ekstraksie gebruik word, insluitend maar nie beperk nie tot vaderskaptoetsing, forensiese en genomika.
'n Kort geskiedenis van nukleïensuurekstraksie
DNA onttrekkingdateer ver terug, met die eerste bekende isolasie wat in 1869 deur 'n Switserse geneesheer genaamd Friedrich Miescher uitgevoer is. Miescher het gehoop om die fundamentele beginsels van lewe op te los deur die chemiese samestelling van selle te bepaal.Nadat hy met limfosiete misluk het, kon hy 'n ru-neerslag van DNS verkry van leukosiete wat in etter op weggegooide verbande gevind is.Hy het dit gedoen deur suur en dan alkali by die sel te voeg om die sel se sitoplasma te verlaat, en toe ’n protokol ontwikkel om die DNS van die ander proteïene te skei.
Na aanleiding van Miescher se baanbrekende navorsing, het baie ander wetenskaplikes voortgegaan om te bevorder en tegnieke te ontwikkel om DNS te isoleer en te suiwer.Edwin Joseph Cohn, 'n proteïenwetenskaplike het baie tegnieke vir proteïensuiwering tydens WW2 ontwikkel.Hy was verantwoordelik vir die isolering van die serumalbumienfraksie van bloedplasma, wat belangrik is om die osmotiese druk in die bloedvate te handhaaf.Dit was van kardinale belang om soldate aan die lewe te hou.
In 1953 het Francis Crick, saam met Rosalind Franklin en James Watson, die struktuur van DNS bepaal, wat gewys het dat dit uit twee stringe lang kettings nukleïensuurnukleotiede bestaan.Hierdie deurbraak-ontdekking het die weg gebaan vir Meselson en Stahl, wat in staat was om 'n digtheidsgradiënt-sentrifugeringsprotokol te ontwikkel om DNS van E. Coli-bakterieë te isoleer, aangesien hulle die semi-konserwatiewe replikasie van DNS tydens hul 1958-eksperiment gedemonstreer het.
Tegnieke van nukleïensuurekstraksie
Wat is die 4 stadiums van DNA-ekstraksie?
Alle ekstraksiemetodes kom neer op dieselfde fundamentele stappe.
Sel ontwrigting.Hierdie stadium, ook bekend as sellise, behels die afbreek van die selwand en/of die selmembraan, ten einde die intra-sellulêre vloeistowwe vry te stel wat die nukleïensure van belang bevat.
Verwydering van ongewenste puin.Dit sluit membraanlipiede, proteïene en ander ongewenste nukleïensure in wat met stroomaftoediening kan inmeng.
Isolasie.Daar is 'n aantal verskillende maniere om die nukleïensure van belang te isoleer van die skoongemaakte lysaat wat jy geskep het, wat tussen twee hoofkategorieë val: oplossingsgebaseerde of vaste toestand (sien volgende afdeling).
Konsentrasie.Nadat die nukleïensure van alle ander kontaminante en verdunningsmiddels geïsoleer is, word dit in 'n hoogs gekonsentreerde eluaat aangebied.
Die twee tipes onttrekking
Daar is twee tipes nukleïensuur-ekstraksie – oplossinggebaseerde metodes en vastestofmetodes.Die oplossingsgebaseerde metode staan ook bekend as die chemiese ekstraksiemetode, aangesien dit die gebruik van chemikalieë behels om die sel af te breek en toegang tot die nukleïenmateriaal te verkry.Dit kan óf organiese verbindings soos fenol en chloroform gebruik, óf die minder skadelike en dus meer aanbevole anorganiese verbindings soos Proteinase K of silikagel.
Voorbeelde van verskillende chemiese ekstraksiemetodes om 'n sel af te breek sluit in:
- Osmotiese breuk van membraan
- Ensiematiese vertering van selwand
- Oplosbaarheid van membraan
- Met skoonmaakmiddels
- Met alkalibehandeling
Vastetoestandtegnieke, ook bekend as meganiese metodes, behels die ontginning van hoe DNA met 'n soliede substraat in wisselwerking tree.Deur 'n kraal of molekule te kies waaraan die DNS sal bind, maar die analiet nie sal nie, is dit moontlik om die twee te skei.Voorbeelde van soliede-fase ekstraksie tegnieke insluitend die gebruik van silika en magnetiese krale.
Magnetiese kraalonttrekking verduidelik
Die Magnetiese Krale Onttrekking Metode
Die potensiaal vir ekstraksie met behulp van magnetiese krale is die eerste keer erken in 'n Amerikaanse patent wat deur Trevor Hawkins, vir die Whitehead Institute-navorsingsinstelling, ingedien is.Hierdie patent het erken dat dit moontlik was om genetiese materiaal te onttrek deur dit aan 'n soliede ondersteuningsdraer te bind, wat 'n magnetiese kraal kan wees.Die beginsel is dat jy 'n hoogs gefunksionaliseerde magnetiese kraal gebruik waaraan die genetiese materiaal sal bind, wat dan van die supernatant geskei kan word deur 'n magnetiese krag aan die buitekant van die houer wat die monster hou toe te pas.
Hoekom gebruik magnetiese kraal-ekstraksie?
Magnetiese krale-ekstraksietegnologie word al hoe meer algemeen, as gevolg van die potensiaal wat dit inhou vir vinnige en doeltreffende onttrekkingsprosedures.In onlangse tye was daar ontwikkelings van hoogs gefunksionaliseerde magnetiese krale met geskikte bufferstelsels, wat outomatisering van nukleïensuurekstraksie moontlik gemaak het en 'n werkvloei wat baie hulpbronlig en kostedoeltreffend is.Magnetiese krale-ekstraksiemetodes behels ook nie die sentrifugeringstappe wat skuifkragte kan veroorsaak wat langer stukke DNA opbreek nie.Dit beteken dat langer DNA-stringe ongeskonde bly, wat belangrik is in genomika-toetsing.
Pos tyd: Nov-25-2022