pengenalan
Apakah Pengekstrakan Asid Nukleik?
Dalam istilah yang paling mudah, pengekstrakan asid nukleik ialah penyingkiran RNA dan/atau DNA daripada sampel dan semua lebihan yang tidak diperlukan.Proses pengekstrakan mengasingkan asid nukleik daripada sampel dan menghasilkannya dalam bentuk eluat pekat, bebas daripada pelarut dan bahan cemar yang boleh menjejaskan sebarang aplikasi hiliran.
Aplikasi Pengekstrakan Asid Nukleik
Asid nukleik yang telah dimurnikan digunakan dalam pelbagai aplikasi yang berbeza, merangkumi pelbagai industri yang berbeza.Penjagaan kesihatan mungkin merupakan kawasan yang paling banyak digunakan, dengan RNA dan DNA tulen yang diperlukan untuk pelbagai tujuan ujian yang berbeza.
Aplikasi pengekstrakan asid nukleik dalam penjagaan kesihatan termasuk:
- Penjujukan Generasi Seterusnya (NGS)
- Genotaip SNP berasaskan amplifikasi
- Genotaip berasaskan tatasusunan
- Penghadaman Enzim Sekatan
- Menganalisis menggunakan Enzim Pengubahsuaian (cth Ligasi dan Pengklonan)
Terdapat juga bidang lain di luar penjagaan kesihatan di mana pengekstrakan asid nukleik digunakan, termasuk tetapi tidak terhad kepada ujian paterniti, forensik dan genomik.
Sejarah Ringkas Pengekstrakan Asid Nukleik
Pengekstrakan DNAbermula sejak jauh, dengan pengasingan pertama yang diketahui telah dilakukan oleh seorang pakar perubatan Switzerland bernama Friedrich Miescher pada tahun 1869. Miescher berharap untuk menyelesaikan prinsip asas kehidupan dengan menentukan komposisi kimia sel.Selepas gagal dengan limfosit, dia dapat memperoleh mendakan kasar DNA daripada leukosit yang terdapat dalam nanah pada pembalut yang dibuang.Dia melakukan ini dengan menambahkan asid dan kemudian alkali ke sel untuk meninggalkan sitoplasma sel, dan kemudian membangunkan protokol untuk memisahkan DNA daripada protein lain.
Berikutan penyelidikan pecah tanah Miescher, ramai saintis lain telah memajukan dan membangunkan teknik untuk mengasingkan dan memurnikan DNA.Edwin Joseph Cohn, seorang saintis protein membangunkan banyak teknik untuk penulenan protein semasa Perang Dunia Kedua.Dia bertanggungjawab untuk mengasingkan pecahan serum albumin plasma darah, yang penting dalam mengekalkan tekanan osmotik dalam saluran darah.Ini adalah penting untuk memastikan tentera hidup.
Pada tahun 1953 Francis Crick, bersama Rosalind Franklin dan James Watson, menentukan struktur DNA, menunjukkan bahawa ia terdiri daripada dua helai rantai panjang nukleotida asid nukleik.Penemuan terobosan ini membuka jalan kepada Meselson dan Stahl, yang dapat membangunkan protokol sentrifugasi kecerunan ketumpatan untuk mengasingkan DNA daripada bakteria E. Coli ketika mereka menunjukkan replikasi DNA separa konservatif semasa eksperimen 1958 mereka.
Teknik Pengekstrakan Asid Nukleik
Apakah 4 peringkat pengekstrakan DNA?
Semua kaedah pengekstrakan bermuara kepada langkah asas yang sama.
Gangguan Sel.Peringkat ini, juga dikenali sebagai lisis sel, melibatkan pemecahan dinding sel dan/atau membran sel, untuk membebaskan cecair intra-sel yang mengandungi asid nukleik yang menarik.
Pembuangan Serpihan yang Tidak Diingini.Ini termasuk lipid membran, protein dan asid nukleik lain yang tidak diingini yang boleh mengganggu aplikasi hiliran.
Pengasingan.Terdapat beberapa cara berbeza untuk mengasingkan asid nukleik yang diminati daripada lysate dibersihkan yang anda cipta, yang termasuk di antara dua kategori utama: berasaskan larutan atau keadaan pepejal (lihat bahagian seterusnya).
penumpuan.Selepas asid nukleik telah diasingkan daripada semua bahan cemar dan pelarut lain, ia dibentangkan dalam eluat yang sangat pekat.
Dua Jenis Pengekstrakan
Terdapat dua jenis pengekstrakan asid nukleik - kaedah berasaskan larutan dan kaedah keadaan pepejal.Kaedah berasaskan penyelesaian juga dikenali sebagai kaedah pengekstrakan kimia, kerana ia melibatkan penggunaan bahan kimia untuk memecahkan sel dan mengakses bahan nukleik.Ini boleh menggunakan sama ada sebatian organik seperti fenol dan kloroform, atau sebatian tak organik yang kurang berbahaya dan oleh itu lebih disyorkan seperti Proteinase K atau gel silika.
Contoh kaedah pengekstrakan kimia yang berbeza untuk memecahkan sel termasuk:
- Pecah osmotik membran
- Pencernaan enzimatik dinding sel
- Pelarutan membran
- Dengan detergen
- Dengan rawatan alkali
Teknik keadaan pepejal, juga dikenali sebagai kaedah mekanikal, melibatkan mengeksploitasi cara DNA berinteraksi dengan substrat pepejal.Dengan memilih manik atau molekul yang akan diikat oleh DNA tetapi analit tidak akan, adalah mungkin untuk memisahkan kedua-duanya.Contoh teknik pengekstrakan fasa pepejal termasuk menggunakan silika dan manik magnet.
Pengekstrakan Manik Magnet Diterangkan
Kaedah Pengekstrakan Manik Magnet
Potensi pengekstrakan menggunakan manik magnet pertama kali diiktiraf dalam paten AS yang difailkan oleh Trevor Hawkins, untuk institusi penyelidikan Institut Whitehead.Paten ini mengakui bahawa adalah mungkin untuk mengekstrak bahan genetik dengan mengikatnya pada pembawa sokongan pepejal, yang boleh menjadi manik magnet.Prinsipnya ialah anda menggunakan manik magnet yang sangat berfungsi di mana bahan genetik akan diikat, yang kemudiannya boleh dipisahkan daripada supernatan dengan menggunakan daya magnet pada bahagian luar kapal yang memegang sampel.
Mengapa Menggunakan Pengekstrakan Manik Magnetik?
Teknologi pengekstrakan manik magnetik menjadi semakin berleluasa, kerana potensi yang dimilikinya untuk prosedur pengekstrakan yang cepat dan cekap.Sejak kebelakangan ini terdapat perkembangan manik magnetik yang sangat berfungsi dengan sistem penimbal yang sesuai, yang memungkinkan automasi pengekstrakan asid nukleik dan aliran kerja yang sangat ringan sumber dan menjimatkan kos.Juga, kaedah pengekstrakan manik magnet tidak melibatkan langkah sentrifugasi yang boleh menyebabkan daya ricih yang memecahkan kepingan DNA yang lebih panjang.Ini bermakna untaian DNA yang lebih panjang kekal utuh, yang penting dalam ujian genomik.
Masa siaran: Nov-25-2022