Wstęp
Co to jest ekstrakcja kwasu nukleinowego?
Mówiąc najprościej, ekstrakcja kwasu nukleinowego polega na usunięciu RNA i/lub DNA z próbki oraz całego niepotrzebnego nadmiaru.W procesie ekstrakcji kwasy nukleinowe izoluje się z próbki i otrzymuje się je w postaci stężonego eluatu, wolnego od rozcieńczalników i zanieczyszczeń, które mogłyby mieć wpływ na dalsze zastosowania.
Zastosowania ekstrakcji kwasów nukleinowych
Oczyszczone kwasy nukleinowe są wykorzystywane w wielu różnych zastosowaniach, w wielu różnych gałęziach przemysłu.Być może obszarem, w którym jest on najczęściej stosowany, jest opieka zdrowotna, gdzie oczyszczone RNA i DNA są potrzebne do wielu różnych celów testowych.
Zastosowania ekstrakcji kwasów nukleinowych w opiece zdrowotnej obejmują:
- Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS)
- Genotypowanie SNP w oparciu o amplifikację
- Genotypowanie oparte na tablicach
- Ograniczenie trawienia enzymatycznego
- Analizy z wykorzystaniem enzymów modyfikujących (np. ligacja i klonowanie)
Istnieją również inne dziedziny poza opieką zdrowotną, w których stosuje się ekstrakcję kwasów nukleinowych, w tym między innymi badania na ojcostwo, kryminalistykę i genomikę.
Krótka historia ekstrakcji kwasów nukleinowych
Ekstrakcja DNAsięga daleko wstecz, a pierwszą znaną izolację przeprowadził szwajcarski lekarz Friedrich Miescher w 1869 r. Miescher miał nadzieję rozwiązać podstawowe zasady życia poprzez określenie składu chemicznego komórek.Po niepowodzeniu z limfocytami udało mu się uzyskać surowy osad DNA z leukocytów znalezionych w ropie na wyrzuconych bandażach.Dokonał tego, dodając do komórki kwas, a następnie zasadę, aby opuścić cytoplazmę komórki, a następnie opracował protokół oddzielania DNA od innych białek.
W następstwie przełomowych badań Mieschera wielu innych naukowców poczyniło postępy i rozwijało techniki izolacji i oczyszczania DNA.Edwin Joseph Cohn, badacz białek, opracował wiele technik oczyszczania białek podczas II wojny światowej.Odpowiadał za wyizolowanie frakcji albuminowej z osocza krwi, która odgrywa ważną rolę w utrzymaniu ciśnienia osmotycznego w naczyniach krwionośnych.Miało to kluczowe znaczenie dla utrzymania żołnierzy przy życiu.
W 1953 roku Francis Crick wraz z Rosalind Franklin i Jamesem Watsonem określili strukturę DNA, wykazując, że składa się on z dwóch nici długich łańcuchów nukleotydów kwasów nukleinowych.To przełomowe odkrycie utorowało drogę Meselsonowi i Stahlowi, którym udało się opracować protokół wirowania w gradiencie gęstości w celu wyizolowania DNA z bakterii E. Coli, po tym jak wykazali półkonserwatywną replikację DNA podczas eksperymentu z 1958 roku.
Techniki ekstrakcji kwasów nukleinowych
Jakie są 4 etapy ekstrakcji DNA?
Wszystkie metody ekstrakcji sprowadzają się do tych samych podstawowych etapów.
Zakłócenie komórek.Ten etap, znany również jako liza komórki, obejmuje rozbicie ściany komórkowej i/lub błony komórkowej w celu uwolnienia płynów wewnątrzkomórkowych zawierających interesujące kwasy nukleinowe.
Usuwanie niechcianych śmieci.Obejmuje to lipidy błonowe, białka i inne niepożądane kwasy nukleinowe, które mogą zakłócać dalsze zastosowania.
Izolacja.Istnieje wiele różnych sposobów izolowania odpowiednich kwasów nukleinowych z utworzonego oczyszczonego lizatu, które należą do dwóch głównych kategorii: na bazie roztworu lub w stanie stałym (patrz następna sekcja).
Stężenie.Po wyizolowaniu kwasów nukleinowych od wszystkich innych zanieczyszczeń i rozcieńczalników, są one prezentowane w postaci wysoce stężonego eluatu.
Dwa rodzaje ekstrakcji
Istnieją dwa rodzaje ekstrakcji kwasów nukleinowych – metody oparte na roztworze i metody na ciele stałym.Metoda oparta na roztworze jest również znana jako metoda ekstrakcji chemicznej, ponieważ polega na użyciu substancji chemicznych w celu rozbicia komórki i uzyskania dostępu do materiału nukleinowego.Można w tym przypadku używać związków organicznych, takich jak fenol i chloroform, lub mniej szkodliwych i dlatego bardziej zalecanych związków nieorganicznych, takich jak proteinaza K lub żel krzemionkowy.
Przykłady różnych metod ekstrakcji chemicznej w celu rozbicia komórki obejmują:
- Osmotyczne pęknięcie błony
- Enzymatyczne trawienie ściany komórkowej
- Solubilizacja membrany
- Z detergentami
- Z obróbką alkaliczną
Techniki na ciele stałym, znane również jako metody mechaniczne, obejmują wykorzystanie interakcji DNA ze stałym podłożem.Wybierając kulkę lub cząsteczkę, z którą DNA się zwiąże, ale analit nie, możliwe jest ich rozdzielenie.Przykłady technik ekstrakcji w fazie stałej, w tym z wykorzystaniem krzemionki i kulek magnetycznych.
Wyjaśnienie ekstrakcji kulek magnetycznych
Metoda ekstrakcji kulek magnetycznych
Potencjał ekstrakcji za pomocą kulek magnetycznych został po raz pierwszy dostrzeżony w amerykańskim patencie złożonym przez Trevora Hawkinsa dla instytucji badawczej Whitehead Institute.W patencie tym uznano, że możliwa jest ekstrakcja materiału genetycznego poprzez związanie go ze stałym nośnikiem, którym może być kulka magnetyczna.Zasada jest taka, że wykorzystuje się wysoce funkcjonalizowaną kulkę magnetyczną, z którą zwiąże się materiał genetyczny, który następnie można oddzielić od supernatantu, przykładając siłę magnetyczną do zewnętrznej strony naczynia zawierającego próbkę.
Dlaczego warto stosować ekstrakcję kulkami magnetycznymi?
Technologia ekstrakcji kulkami magnetycznymi staje się coraz bardziej powszechna ze względu na jej potencjał w zakresie szybkich i skutecznych procedur ekstrakcji.W ostatnim czasie opracowano wysoce funkcjonalizowane kulki magnetyczne z odpowiednimi układami buforów, które umożliwiły automatyzację ekstrakcji kwasów nukleinowych i przebieg pracy, który jest bardzo zasobooszczędny i ekonomiczny.Ponadto metody ekstrakcji kulek magnetycznych nie obejmują etapów wirowania, które mogą powodować siły ścinające, które rozbijają dłuższe fragmenty DNA.Oznacza to, że dłuższe nici DNA pozostają nienaruszone, co jest ważne w badaniach genomicznych.
Czas publikacji: 25 listopada 2022 r