Úvod
Čo je extrakcia nukleových kyselín?
Úplne najjednoduchšie povedané, extrakcia nukleových kyselín je odstránenie RNA a/alebo DNA zo vzorky a všetkého nadbytku, ktorý nie je potrebný.Proces extrakcie izoluje nukleové kyseliny zo vzorky a získa ich vo forme koncentrovaného eluátu bez riedidiel a kontaminantov, ktoré by mohli ovplyvniť akékoľvek následné aplikácie.
Aplikácie extrakcie nukleových kyselín
Purifikované nukleové kyseliny sa používajú v množstve rôznych aplikácií, ktoré sa pohybujú v rôznych odvetviach.Zdravotná starostlivosť je možno oblasťou, kde sa používa najviac, pričom purifikovaná RNA a DNA sú potrebné na množstvo rôznych rôznych testovacích účelov.
Aplikácie extrakcie nukleových kyselín v zdravotníctve zahŕňajú:
- sekvenovanie novej generácie (NGS)
- Genotypizácia SNP založená na amplifikácii
- Genotypizácia založená na poliach
- Obmedzenie trávenia enzýmov
- Analýzy pomocou modifikujúcich enzýmov (napr. ligácia a klonovanie)
Okrem zdravotníctva existujú aj ďalšie oblasti, v ktorých sa používa extrakcia nukleových kyselín, vrátane, ale nie výlučne, testovania otcovstva, forenznej analýzy a genomiky.
Stručná história extrakcie nukleových kyselín
Extrakcia DNAsiaha ďaleko do minulosti, pričom prvú známu izoláciu vykonal švajčiarsky lekár Friedrich Miescher v roku 1869. Miescher dúfal, že vyrieši základné princípy života stanovením chemického zloženia buniek.Po zlyhaní s lymfocytmi sa mu podarilo získať surovú zrazeninu DNA z leukocytov nájdených v hnise na odhodených obväzoch.Urobil to tak, že do bunky pridal kyselinu a potom zásadu, aby opustil cytoplazmu bunky, a potom vyvinul protokol na oddelenie DNA od ostatných proteínov.
Po Miescherovom prelomovom výskume mnohí ďalší vedci pokračovali v pokroku a vývoji techník na izoláciu a čistenie DNA.Edwin Joseph Cohn, proteínový vedec, vyvinul mnoho techník na čistenie proteínov počas druhej svetovej vojny.Bol zodpovedný za izoláciu frakcie sérového albumínu z krvnej plazmy, ktorá je dôležitá pri udržiavaní osmotického tlaku v cievach.To bolo rozhodujúce pre udržanie vojakov nažive.
V roku 1953 Francis Crick spolu s Rosalind Franklinovou a Jamesom Watsonom určili štruktúru DNA a ukázali, že sa skladá z dvoch reťazcov dlhých reťazcov nukleotidov nukleových kyselín.Tento prelomový objav vydláždil cestu Meselsonovi a Stahlovi, ktorí boli schopní vyvinúť centrifugačný protokol s hustotným gradientom na izoláciu DNA z baktérií E. Coli, keď počas svojho experimentu v roku 1958 preukázali semikonzervatívnu replikáciu DNA.
Techniky extrakcie nukleových kyselín
Aké sú 4 fázy extrakcie DNA?
Všetky metódy extrakcie sa scvrkávajú na rovnaké základné kroky.
Narušenie buniek.Toto štádium, tiež známe ako lýza buniek, zahŕňa rozpad bunkovej steny a/alebo bunkovej membrány, aby sa uvoľnili vnútrobunkové tekutiny obsahujúce požadované nukleové kyseliny.
Odstránenie nežiaducich nečistôt.To zahŕňa membránové lipidy, proteíny a iné nežiaduce nukleové kyseliny, ktoré môžu interferovať s následnými aplikáciami.
Izolácia.Existuje množstvo rôznych spôsobov, ako izolovať požadované nukleové kyseliny z vyčíreného lyzátu, ktorý ste vytvorili, a ktoré spadajú do dvoch hlavných kategórií: na báze roztoku alebo v tuhom stave (pozri nasledujúcu časť).
Koncentrácia.Potom, čo boli nukleové kyseliny izolované od všetkých ostatných kontaminantov a riedidiel, sú prítomné vo vysoko koncentrovanom eluáte.
Dva typy extrakcie
Existujú dva typy extrakcie nukleových kyselín – metódy založené na roztoku a metódy v tuhom stave.Metóda založená na roztoku je tiež známa ako metóda chemickej extrakcie, pretože zahŕňa použitie chemikálií na rozbitie bunky a prístup k jadrovému materiálu.Môže to byť použitie buď organických zlúčenín, ako je fenol a chloroform, alebo menej škodlivých, a preto viac odporúčaných anorganických zlúčenín, ako je Proteináza K alebo silikagél.
Príklady rôznych metód chemickej extrakcie na rozbitie bunky zahŕňajú:
- Osmotické pretrhnutie membrány
- Enzymatické trávenie bunkovej steny
- Solubilizácia membrány
- S čistiacimi prostriedkami
- S alkalickou úpravou
Techniky v pevnej fáze, známe tiež ako mechanické metódy, zahŕňajú využitie toho, ako DNA interaguje s pevným substrátom.Výberom guľôčky alebo molekuly, na ktorú sa DNA naviaže, ale analyt nie, je možné tieto dve časti oddeliť.Príklady techník extrakcie v pevnej fáze vrátane použitia oxidu kremičitého a magnetických guľôčok.
Vysvetlenie extrakcie magnetických guľôčok
Metóda extrakcie magnetických guľôčok
Potenciál extrakcie pomocou magnetických guľôčok bol prvýkrát uznaný v americkom patente, ktorý podal Trevor Hawkins pre výskumnú inštitúciu Whitehead Institute.Tento patent potvrdil, že je možné extrahovať genetický materiál jeho naviazaním na pevný nosič, ktorým by mohla byť magnetická guľôčka.Princíp spočíva v tom, že používate vysoko funkcionalizovanú magnetickú guľôčku, na ktorú sa naviaže genetický materiál, ktorý sa potom môže oddeliť od supernatantu pôsobením magnetickej sily na vonkajšiu stranu nádoby, v ktorej je vzorka.
Prečo používať extrakciu magnetických guľôčok?
Technológia extrakcie magnetických guľôčok sa stáva čoraz rozšírenejšou kvôli potenciálu, ktorý má pre rýchle a efektívne extrakčné postupy.V poslednom čase došlo k vývoju vysoko funkcionalizovaných magnetických guľôčok s vhodnými tlmivými systémami, ktoré umožnili automatizáciu extrakcie nukleových kyselín a pracovný postup, ktorý je veľmi nenáročný na zdroje a nákladovo efektívny.Metódy extrakcie magnetických guľôčok tiež nezahŕňajú kroky odstreďovania, ktoré môžu spôsobiť šmykové sily, ktoré rozbijú dlhšie kúsky DNA.To znamená, že dlhšie vlákna DNA zostávajú nedotknuté, čo je dôležité pri testovaní genomiky.
Čas odoslania: 25. novembra 2022