Chiết xuất axit nucleic và phương pháp hạt từ tính

Giới thiệu

Chiết xuất axit nucleic là gì?

Nói một cách đơn giản nhất, chiết xuất axit nucleic là loại bỏ RNA và/hoặc DNA khỏi mẫu và tất cả những phần dư thừa không cần thiết.Quá trình chiết tách sẽ phân lập axit nucleic khỏi mẫu và tạo ra chúng ở dạng dịch rửa giải đậm đặc, không chứa chất pha loãng và chất gây ô nhiễm có thể ảnh hưởng đến bất kỳ ứng dụng tiếp theo nào.

Ứng dụng của chiết xuất axit nucleic

Axit nucleic tinh khiết được sử dụng trong rất nhiều ứng dụng khác nhau, trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau.Chăm sóc sức khỏe có lẽ là lĩnh vực được sử dụng nhiều nhất, với RNA và DNA tinh khiết cần thiết cho nhiều mục đích thử nghiệm khác nhau.

Các ứng dụng chiết xuất axit nucleic trong chăm sóc sức khỏe bao gồm:

- Khuếch đại PCR và qPCR

- Trình tự thế hệ tiếp theo (NGS)

- Kiểu gen SNP dựa trên khuếch đại

- Kiểu gen dựa trên mảng

- Hạn chế tiêu hóa enzyme

- Phân tích bằng cách sử dụng Enzyme biến đổi (ví dụ: Thắt và nhân bản)

Ngoài ra còn có các lĩnh vực khác ngoài chăm sóc sức khỏe sử dụng phương pháp chiết xuất axit nucleic, bao gồm nhưng không giới hạn ở xét nghiệm quan hệ cha con, pháp y và gen.

Sơ lược về lịch sử chiết xuất axit nucleic

trích xuất DNAđã có từ rất lâu, với việc phân lập đầu tiên được biết đến được thực hiện bởi một bác sĩ người Thụy Sĩ tên là Friedrich Miescher vào năm 1869. Miescher hy vọng giải quyết được các nguyên tắc cơ bản của sự sống bằng cách xác định thành phần hóa học của tế bào.Sau khi thất bại với tế bào lympho, anh ta đã có thể thu được kết tủa DNA thô từ bạch cầu tìm thấy trong mủ trên băng bỏ đi.Ông đã làm điều này bằng cách thêm axit và sau đó là kiềm vào tế bào để rời khỏi tế bào chất của tế bào, sau đó phát triển một quy trình tách DNA khỏi các protein khác.

Sau nghiên cứu đột phá của Miescher, nhiều nhà khoa học khác đã tiếp tục cải tiến và phát triển các kỹ thuật phân lập và tinh chế DNA.Edwin Joseph Cohn, một nhà khoa học về protein đã phát triển nhiều kỹ thuật tinh chế protein trong Thế chiến thứ 2.Ông chịu trách nhiệm cô lập phần albumin huyết thanh trong huyết tương, điều này rất quan trọng trong việc duy trì áp suất thẩm thấu trong mạch máu.Điều này rất quan trọng để giữ cho binh lính sống sót.

Năm 1953, Francis Crick, cùng với Rosalind Franklin và James Watson, đã xác định được cấu trúc của DNA, cho thấy nó được tạo thành từ hai chuỗi dài các nucleotide axit nucleic.Khám phá mang tính đột phá này đã mở đường cho Meselson và Stahl, những người có thể phát triển quy trình ly tâm gradient mật độ để tách DNA khỏi vi khuẩn E. Coli khi họ chứng minh khả năng sao chép bán bảo toàn của DNA trong thí nghiệm năm 1958 của họ.

Kỹ thuật chiết xuất axit nucleic

4 giai đoạn tách chiết DNA là gì?
Tất cả các phương pháp chiết xuất đều có những bước cơ bản giống nhau.

Sự gián đoạn tế bào.Giai đoạn này, còn được gọi là ly giải tế bào, bao gồm việc phá vỡ thành tế bào và/hoặc màng tế bào để giải phóng chất lỏng nội bào có chứa axit nucleic cần quan tâm.

Loại bỏ các mảnh vụn không mong muốn.Điều này bao gồm lipid màng, protein và các axit nucleic không mong muốn khác có thể cản trở các ứng dụng tiếp theo.

Sự cách ly.Có một số cách khác nhau để tách axit nucleic quan tâm khỏi dịch ly giải đã được làm sạch mà bạn đã tạo, nằm trong hai loại chính: dựa trên dung dịch hoặc trạng thái rắn (xem phần tiếp theo).

Sự tập trung.Sau khi axit nucleic được phân lập khỏi tất cả các chất gây ô nhiễm và chất pha loãng khác, chúng được đưa vào dịch rửa giải có nồng độ cao.

Hai loại khai thác
Có hai loại chiết xuất axit nucleic – phương pháp dựa trên dung dịch và phương pháp trạng thái rắn.Phương pháp dựa trên dung dịch còn được gọi là phương pháp chiết xuất hóa học, vì nó liên quan đến việc sử dụng hóa chất để phá vỡ tế bào và tiếp cận vật liệu nucleic.Điều này có thể sử dụng các hợp chất hữu cơ như phenol và chloroform, hoặc các hợp chất vô cơ ít gây hại hơn và do đó được khuyên dùng nhiều hơn như Proteinase K hoặc silica gel.

Ví dụ về các phương pháp chiết xuất hóa học khác nhau để phá vỡ tế bào bao gồm:

- Vỡ màng thẩm thấu

- Enzym tiêu hóa vách tế bào

- Hòa tan màng

- Với chất tẩy rửa

- Xử lý bằng kiềm

Kỹ thuật trạng thái rắn, còn được gọi là phương pháp cơ học, liên quan đến việc khai thác cách DNA tương tác với chất nền rắn.Bằng cách chọn một hạt hoặc phân tử mà DNA sẽ liên kết nhưng chất phân tích thì không, có thể tách chúng ra.Ví dụ về kỹ thuật chiết pha rắn bao gồm sử dụng silica và hạt từ tính.

Giải thích về khai thác hạt từ tính

Phương pháp chiết hạt từ tính
Tiềm năng chiết xuất bằng cách sử dụng hạt từ tính lần đầu tiên được công nhận trong bằng sáng chế của Hoa Kỳ do Trevor Hawkins nộp cho cơ quan nghiên cứu Viện Whitehead.Bằng sáng chế này thừa nhận rằng có thể trích xuất vật liệu di truyền bằng cách liên kết chúng với một chất mang rắn hỗ trợ, có thể là một hạt từ tính.Nguyên tắc là bạn sử dụng một hạt từ tính có chức năng cao mà vật liệu di truyền sẽ liên kết vào đó, sau đó có thể tách hạt này ra khỏi phần nổi phía trên bằng cách tác dụng một lực từ lên bên ngoài bình chứa mẫu.

Tại sao nên sử dụng chiết xuất hạt từ tính?
Công nghệ chiết hạt từ tính ngày càng trở nên phổ biến do tiềm năng của nó cho các quy trình chiết xuất nhanh chóng và hiệu quả.Trong thời gian gần đây, đã có sự phát triển về các hạt từ tính có chức năng cao với hệ thống đệm phù hợp, giúp tự động hóa quá trình chiết xuất axit nucleic và quy trình làm việc rất tiết kiệm tài nguyên và tiết kiệm chi phí.Ngoài ra, phương pháp chiết hạt từ tính không bao gồm các bước ly tâm có thể gây ra lực cắt làm phá vỡ các đoạn DNA dài hơn.Điều này có nghĩa là các chuỗi DNA dài hơn vẫn còn nguyên vẹn, điều này rất quan trọng trong xét nghiệm gen.