Introdução
O que é extração de ácido nucléico?
Nos termos mais simples, a extração de ácido nucleico é a remoção do RNA e/ou DNA de uma amostra e de todo o excesso desnecessário.O processo de extração isola os ácidos nucleicos de uma amostra e os produz na forma de um eluato concentrado, livre de diluentes e contaminantes que possam afetar quaisquer aplicações posteriores.
Aplicações de extração de ácido nucléico
Os ácidos nucleicos purificados são usados em uma infinidade de aplicações diferentes, abrangendo vários setores diferentes.A saúde é talvez a área onde é mais utilizado, com RNA e DNA purificados necessários para uma série de diferentes finalidades de teste.
As aplicações de extração de ácido nucleico na área da saúde incluem:
- Sequenciamento de Próxima Geração (NGS)
- Genotipagem SNP baseada em amplificação
- Genotipagem baseada em array
- Digestão de enzimas de restrição
- Análises utilizando Enzimas Modificadoras (ex. Ligação e Clonagem)
Existem também outros campos além dos cuidados de saúde onde a extracção de ácido nucleico é utilizada, incluindo, entre outros, testes de paternidade, medicina forense e genómica.
Uma Breve História da Extração de Ácido Nucleico
Extração de DNAremonta a muito tempo atrás, com o primeiro isolamento conhecido tendo sido realizado por um médico suíço chamado Friedrich Miescher em 1869. Miescher esperava resolver os princípios fundamentais da vida determinando a composição química das células.Depois de falhar com os linfócitos, ele conseguiu obter um precipitado bruto de DNA de leucócitos encontrados no pus de bandagens descartadas.Ele fez isso adicionando ácido e depois álcali à célula para sair do citoplasma da célula, e então desenvolveu um protocolo para separar o DNA das outras proteínas.
Seguindo a pesquisa inovadora de Miescher, muitos outros cientistas avançaram e desenvolveram técnicas para isolar e purificar o DNA.Edwin Joseph Cohn, um cientista de proteínas desenvolveu muitas técnicas para purificação de proteínas durante a Segunda Guerra Mundial.Ele foi responsável por isolar a fração sérica de albumina do plasma sanguíneo, importante na manutenção da pressão osmótica nos vasos sanguíneos.Isso foi crucial para manter os soldados vivos.
Em 1953, Francis Crick, juntamente com Rosalind Franklin e James Watson, determinaram a estrutura do DNA, mostrando que era composto por duas cadeias longas de nucleotídeos de ácidos nucléicos.Esta descoberta revolucionária abriu caminho para Meselson e Stahl, que foram capazes de desenvolver um protocolo de centrifugação em gradiente de densidade para isolar o DNA da bactéria E. Coli enquanto demonstravam a replicação semiconservadora do DNA durante seu experimento de 1958.
Técnicas de Extração de Ácido Nucleico
Quais são os 4 estágios da extração de DNA?
Todos os métodos de extração se resumem às mesmas etapas fundamentais.
Ruptura celular.Esta etapa, também conhecida como lise celular, envolve a quebra da parede celular e/ou da membrana celular, para liberar os fluidos intracelulares contendo os ácidos nucléicos de interesse.
Remoção de detritos indesejados.Isto inclui lipídios de membrana, proteínas e outros ácidos nucleicos indesejados que podem interferir nas aplicações a jusante.
Isolamento.Existem várias maneiras diferentes de isolar os ácidos nucleicos de interesse do lisado limpo que você criou, que se enquadram em duas categorias principais: baseado em solução ou em estado sólido (veja a próxima seção).
Concentração.Após os ácidos nucleicos terem sido isolados de todos os outros contaminantes e diluentes, eles são apresentados num eluato altamente concentrado.
Os dois tipos de extração
Existem dois tipos de extração de ácido nucleico – métodos baseados em solução e métodos de estado sólido.O método baseado em solução também é conhecido como método de extração química, pois envolve o uso de produtos químicos para quebrar a célula e acessar o material nucleico.Isso pode ser feito com compostos orgânicos, como fenol e clorofórmio, ou compostos inorgânicos menos prejudiciais e, portanto, mais recomendados, como Proteinase K ou sílica gel.
Exemplos de diferentes métodos de extração química para quebrar uma célula incluem:
- Ruptura osmótica da membrana
- Digestão enzimática da parede celular
- Solubilização da membrana
- Com detergentes
- Com tratamento alcalino
As técnicas de estado sólido, também conhecidas como métodos mecânicos, envolvem a exploração de como o DNA interage com um substrato sólido.Ao selecionar uma esfera ou molécula à qual o DNA se ligará, mas o analito não, é possível separar os dois.Exemplos de técnicas de extração em fase sólida, incluindo o uso de sílica e esferas magnéticas.
Extração de contas magnéticas explicada
O método de extração de contas magnéticas
O potencial de extração usando esferas magnéticas foi reconhecido pela primeira vez em uma patente norte-americana registrada por Trevor Hawkins, para a instituição de pesquisa do Instituto Whitehead.Esta patente reconheceu que era possível extrair material genético ligando-o a um suporte sólido, que poderia ser uma esfera magnética.O princípio é que você use uma esfera magnética altamente funcionalizada à qual o material genético se ligará, que pode então ser separado do sobrenadante aplicando uma força magnética na parte externa do recipiente que contém a amostra.
Por que usar a extração de esferas magnéticas?
A tecnologia de extração de esferas magnéticas está se tornando cada vez mais prevalente, devido ao potencial que possui para procedimentos de extração rápidos e eficientes.Nos últimos tempos, tem havido desenvolvimentos de esferas magnéticas altamente funcionalizadas com sistemas tampão adequados, que tornaram possível a automação da extração de ácido nucleico e um fluxo de trabalho que é muito leve em termos de recursos e econômico.Além disso, os métodos de extração de esferas magnéticas não envolvem etapas de centrifugação que podem causar forças de cisalhamento que quebram pedaços mais longos de DNA.Isto significa que cadeias mais longas de ADN permanecem intactas, o que é importante nos testes genómicos.
Horário da postagem: 25 de novembro de 2022