Za uspešne reakcije amplifikacije je nujno, da so posamezne reakcijske komponente prisotne v pravilni koncentraciji v vsakem pripravku. Poleg tega je pomembno, da ne pride do kontaminacije.
Še posebej, kadar je treba nastaviti veliko reakcij, se je uveljavilo, da se namesto pipetiranja vsakega reagenta posebej v vsako posodo pripravi tako imenovana glavna mešanica. Komercialno so na voljo vnaprej konfigurirane mešanice, v katere se dodajo le komponente, specifične za vzorec (primer), in voda. Lahko pa glavno mešanico pripravite tudi sami. V obeh različicah se mešanica porazdeli v vsako posodo za PCR brez predloge, posamezni vzorec DNK pa se na koncu doda ločeno.
Uporaba glavne mešanice ima več prednosti: Prvič, zmanjša se število posameznih korakov pipetiranja. Na ta način se zmanjša tako tveganje za napake uporabnika med pipetiranjem kot tudi tveganje kontaminacije, seveda pa se prihrani čas. Načeloma je tudi natančnost pipetiranja večja, saj se odmerjajo večje količine. To je enostavno razumeti pri preverjanju tehničnih podatkov pipet: manjši kot je odmerjeni volumen, večja so lahko odstopanja. Dejstvo, da vsi pripravki prihajajo iz iste posode, pozitivno vpliva na homogenost (če so dobro premešani). To izboljša tudi ponovljivost poskusov.
Pri pripravi glavne mešanice je treba dodati vsaj 10 % dodatnega volumna (npr. če je potrebnih 10 pripravkov, izračunajte na podlagi 11), da se tudi zadnja posoda pravilno napolni. Na ta način je mogoče kompenzirati (manjše) netočnosti pipetiranja in učinek izgube vzorca pri doziranju raztopin, ki vsebujejo detergente. Detergenti so vsebovani v encimskih raztopinah, kot so polimeraze in glavne mešanice, kar povzroča nastanek pene in ostankov na notranji površini normalne...konice pipet.
Glede na uporabo in vrsto tekočine, ki jo je treba odmeriti, je treba izbrati pravilno tehniko pipetiranja (1) in ustrezno opremo. Za raztopine, ki vsebujejo detergente, se kot alternativa pipetam z zračno blazino priporoča sistem neposrednega izpodrivanja ali tako imenovane konice pipet z "nizko retencijo". UčinekKonica pipete ACEtemelji na posebej hidrofobni površini. Tekočine, ki vsebujejo detergente, ne puščajo ostankov na notranji in zunanji strani, tako da je izguba raztopine čim manjša.
Poleg natančnega odmerjanja vseh komponent je pomembno tudi, da ne pride do kontaminacije pripravkov. Ni dovolj uporabiti potrošnega materiala visoke čistosti, saj lahko postopek pipetiranja v pipeti z zračno blazino povzroči aerosole, ki ostanejo v pipeti. DNK, ki je lahko vsebovana v aerosolu, se lahko v naslednjem koraku pipetiranja prenese iz enega vzorca v drugega in tako povzroči kontaminacijo. Zgoraj omenjeni sistemi neposrednega izpodrivanja lahko to tveganje tudi zmanjšajo. Pri pipetah z zračno blazino je smiselno uporabiti filtrirne konice za zaščito stožca pipete z zadrževanjem brizg, aerosolov in biomolekul.
Čas objave: 6. dec. 2022