Pre úspešné amplifikačné reakcie je nevyhnutné, aby boli jednotlivé reakčné zložky prítomné v správnej koncentrácii v každom prípravku. Okrem toho je dôležité, aby nedošlo ku kontaminácii.
Najmä keď je potrebné nastaviť veľa reakcií, bolo zavedené pripraviť takzvaný master mix namiesto pipetovania každého činidla samostatne do každej nádoby. Komerčne dostupné sú predkonfigurované zmesi, do ktorých sa pridávajú iba zložky špecifické pre vzorku (primer) a voda. Alternatívne si môžete master mix pripraviť sami. V oboch variantoch sa zmes distribuuje do každej PCR nádoby bez templátu a individuálna vzorka DNA sa pridáva samostatne na konci.
Použitie hlavnej zmesi má niekoľko výhod: Po prvé, znižuje sa počet krokov pipetovania. Týmto spôsobom sa minimalizuje riziko chýb používateľa počas pipetovania aj riziko kontaminácie a samozrejme sa šetrí čas. V princípe je presnosť pipetovania tiež vyššia, pretože sa dávkujú väčšie objemy. To je ľahké pochopiť pri kontrole technických údajov pipiet: Čím menší je dávkovaný objem, tým vyššie môžu byť odchýlky. Skutočnosť, že všetky prípravky pochádzajú z tej istej nádoby, má pozitívny vplyv na homogenitu (ak sú dobre premiešané). To tiež zlepšuje reprodukovateľnosť experimentov.
Pri príprave hlavnej zmesi by sa malo pridať aspoň 10 % objemu navyše (napr. ak je potrebných 10 príprav, vypočítajte na základe 11), aby sa aj posledná nádoba správne naplnila. Týmto spôsobom je možné kompenzovať (mierne) nepresnosti pipetovania a vplyv straty vzorky pri dávkovaní roztokov obsahujúcich detergenty. Detergenty sú obsiahnuté v enzýmových roztokoch, ako sú polymerázy a hlavné zmesi, čo spôsobuje tvorbu peny a zvyškov na vnútornom povrchu normálnych...hroty pipety.
V závislosti od aplikácie a typu dávkovanej kvapaliny by sa mala zvoliť správna pipetovacia technika (1) a vhodné zariadenie. Pre roztoky obsahujúce detergenty sa odporúča systém priameho vytláčania alebo tzv. pipetovacie špičky s „nízkou retenciou“ ako alternatíva k pipetám so vzduchovým vankúšom. ÚčinokŠpička ACE PIPETYje založený na obzvlášť hydrofóbnom povrchu. Tekutiny obsahujúce čistiace prostriedky nezanechávajú na vnútornej ani vonkajšej strane film zvyškov, takže sa minimalizuje strata roztoku.
Okrem presného dávkovania všetkých zložiek je dôležité aj to, aby nedošlo ku kontaminácii prípravkov. Nestačí použiť spotrebný materiál s vysokou čistotou, pretože proces pipetovania v pipete so vzduchovým vankúšom môže produkovať aerosóly, ktoré zostávajú v pipete. DNA, ktorá môže byť obsiahnutá v aerosóle, sa môže v nasledujúcom kroku pipetovania preniesť z jednej vzorky do druhej, a tým viesť ku kontaminácii. Vyššie uvedené systémy priameho vytlačenia môžu toto riziko tiež minimalizovať. Pri pipetách so vzduchovým vankúšom má zmysel používať filtračné špičky na ochranu kužeľa pipety zachytávaním striekajúcej kvapaliny, aerosólov a biomolekúl.
Čas uverejnenia: 6. decembra 2022