For vellykkede amplifiseringsreaksjoner er det nødvendig at de individuelle reaksjonskomponentene er tilstede i riktig konsentrasjon i hvert preparat. I tillegg er det viktig at det ikke oppstår kontaminering.
Spesielt når mange reaksjoner må settes opp, har det blitt etablert å lage en såkalt mastermiks i stedet for å pipettere hvert reagens separat i hver beholder. Forhåndskonfigurerte blandinger er kommersielt tilgjengelige, der kun prøvespesifikke komponenter (primer) og vann tilsettes. Alternativt kan mastermiksen lages selv. I begge variantene fordeles blandingen til hver PCR-beholder uten mal, og den individuelle DNA-prøven tilsettes separat til slutt.
Bruk av en mastermiks har flere fordeler: For det første reduseres antallet enkeltstående pipetteringstrinn. På denne måten minimeres både risikoen for brukerfeil under pipettering og risikoen for kontaminering, og selvfølgelig spares tid. I prinsippet er pipetteringsnøyaktigheten også høyere, siden større volumer doseres. Dette er lett å forstå når man sjekker de tekniske dataene til pipetter: Jo mindre dosert volum, desto høyere kan avvikene være. Det faktum at alle preparater kommer fra samme beholder har en positiv effekt på homogeniteten (hvis godt blandet). Dette forbedrer også reproduserbarheten av forsøkene.
Ved tilberedning av mastermiksen bør minst 10 % ekstra volum tilsettes (f.eks. hvis det kreves 10 tilberedninger, beregn ut fra 11), slik at selv den siste beholderen fylles riktig. På denne måten kan (små) pipetteringsunøyaktigheter og effekten av prøvetap ved dosering av vaskemiddelholdige løsninger kompenseres. Vaskemidler finnes i enzymløsninger som polymeraser og mastermikser, noe som forårsaker skumdannelse og rester på den indre overflaten av normalepipettespisser.
Avhengig av bruksområdet og typen væske som skal dispenseres, bør riktig pipetteringsteknikk (1) velges og passende utstyr velges. For løsninger som inneholder vaskemidler anbefales et direkte fortrengningssystem eller såkalte pipettespisser med «lav retensjon» som et alternativ til luftputepipetter. Effekten avACE PIPETTE-spisser basert på en spesielt hydrofob overflate. Væsker som inneholder vaskemidler etterlater ikke en restfilm på innsiden og utsiden, slik at tapet av løsning kan minimeres.
I tillegg til nøyaktig dosering av alle komponenter, er det også viktig at det ikke oppstår kontaminering av preparatene. Det er ikke tilstrekkelig å bruke forbruksvarer med høy renhet, fordi pipetteringsprosessen i en luftputepipetter kan produsere aerosoler som forblir i pipetten. DNA-et som kan være i aerosolen, kan overføres fra en prøve til den neste i det påfølgende pipetteringstrinnet og dermed føre til kontaminering. De direkte fortrengningssystemene som er nevnt ovenfor, kan også minimere denne risikoen. For luftputepipetter er det fornuftig å bruke filterspisser for å beskytte pipettekjeglen ved å holde tilbake sprut, aerosoler og biomolekyler.
Publisert: 06. des. 2022