Για επιτυχημένες αντιδράσεις ενίσχυσης, είναι απαραίτητο τα επιμέρους συστατικά της αντίδρασης να υπάρχουν στη σωστή συγκέντρωση σε κάθε παρασκεύασμα. Επιπλέον, είναι σημαντικό να μην προκληθεί μόλυνση.
Ειδικά όταν πρέπει να ρυθμιστούν πολλές αντιδράσεις, έχει καθιερωθεί η παρασκευή ενός λεγόμενου κύριου μείγματος αντί της πιπέτας για κάθε αντιδραστήριο ξεχωριστά σε κάθε δοχείο. Διατίθενται στο εμπόριο προδιαμορφωμένα μείγματα, στα οποία προστίθενται μόνο συστατικά ειδικά για το δείγμα (εκκινητής) και νερό. Εναλλακτικά, το κύριο μείγμα μπορεί να παρασκευαστεί από εσάς τους ίδιους. Και στις δύο παραλλαγές, το μείγμα κατανέμεται σε κάθε δοχείο PCR χωρίς πρότυπο και το μεμονωμένο δείγμα DNA προστίθεται ξεχωριστά στο τέλος.
Η χρήση ενός κύριου μείγματος έχει πολλά πλεονεκτήματα: Πρώτον, μειώνεται ο αριθμός των μεμονωμένων βημάτων πιπέτας. Με αυτόν τον τρόπο, ελαχιστοποιείται τόσο ο κίνδυνος σφαλμάτων του χρήστη κατά την πιπέτα όσο και ο κίνδυνος μόλυνσης και, φυσικά, εξοικονομείται χρόνος. Κατ' αρχήν, η ακρίβεια της πιπέτας είναι επίσης υψηλότερη, καθώς δοσολογούνται μεγαλύτεροι όγκοι. Αυτό είναι εύκολο να γίνει κατανοητό κατά τον έλεγχο των τεχνικών δεδομένων των πιπετών: Όσο μικρότερος είναι ο δοσολογημένος όγκος, τόσο μεγαλύτερες μπορεί να είναι οι αποκλίσεις. Το γεγονός ότι όλα τα παρασκευάσματα προέρχονται από το ίδιο δοχείο έχει θετική επίδραση στην ομοιογένεια (εάν αναμειχθούν καλά). Αυτό βελτιώνει επίσης την αναπαραγωγιμότητα των πειραμάτων.
Κατά την προετοιμασία του κύριου μείγματος, θα πρέπει να προστεθεί τουλάχιστον 10% επιπλέον όγκος (π.χ. εάν απαιτούνται 10 παρασκευάσματα, υπολογίστε με βάση το 11), έτσι ώστε ακόμη και το τελευταίο δοχείο να γεμίσει σωστά. Με αυτόν τον τρόπο, μπορούν να αντισταθμιστούν οι (μικρές) ανακρίβειες στην πιπέτα και η επίδραση της απώλειας δείγματος κατά τη δοσολογία διαλυμάτων που περιέχουν απορρυπαντικό. Τα απορρυπαντικά περιέχονται σε διαλύματα ενζύμων όπως οι πολυμεράσες και τα κύρια μείγματα, προκαλώντας σχηματισμό αφρού και υπολειμμάτων στην εσωτερική επιφάνεια των κανονικών.άκρες πιπέτας.
Ανάλογα με την εφαρμογή και τον τύπο του υγρού που πρόκειται να χορηγηθεί, θα πρέπει να επιλεγεί η σωστή τεχνική πιπέτας (1) και ο κατάλληλος εξοπλισμός. Για διαλύματα που περιέχουν απορρυπαντικά, συνιστάται ένα σύστημα άμεσης εκτόπισης ή οι λεγόμενες άκρες πιπέτας «χαμηλής κατακράτησης» ως εναλλακτική λύση στις πιπέτες με αεροστρώμα. Η επίδραση τουΆκρο πιπέτας ACEβασίζεται σε μια ιδιαίτερα υδρόφοβη επιφάνεια. Τα υγρά που περιέχουν απορρυπαντικά δεν αφήνουν φιλμ υπολειμμάτων στο εσωτερικό και στο εξωτερικό, έτσι ώστε να ελαχιστοποιείται η απώλεια διαλύματος.
Εκτός από την ακριβή δοσολογία όλων των συστατικών, είναι επίσης σημαντικό να μην προκληθεί μόλυνση των παρασκευασμάτων. Δεν αρκεί η χρήση αναλώσιμων υψηλής καθαρότητας, επειδή η διαδικασία πιπέτας σε μια πιπέτα με αερόστρωμα μπορεί να παράγει αερολύματα που παραμένουν στην πιπέτα. Το DNA που μπορεί να περιέχεται στο αεροζόλ μπορεί να μεταφερθεί από το ένα δείγμα στο επόμενο στο επόμενο βήμα πιπέτας και έτσι να οδηγήσει σε μόλυνση. Τα συστήματα άμεσης μετατόπισης που αναφέρθηκαν παραπάνω μπορούν επίσης να ελαχιστοποιήσουν αυτόν τον κίνδυνο. Για τις πιπέτες με αερόστρωμα είναι λογικό να χρησιμοποιούνται άκρα φίλτρου για την προστασία του κώνου της πιπέτας συγκρατώντας πιτσιλιές, αερολύματα και βιομόρια.
Ώρα δημοσίευσης: 06-12-2022