For at amplifikationsreaktionerne skal lykkes, er det nødvendigt, at de enkelte reaktionskomponenter er til stede i den korrekte koncentration i hvert præparat. Derudover er det vigtigt, at der ikke forekommer kontaminering.
Især når mange reaktioner skal sættes op, er det blevet etableret at forberede en såkaldt mastermix i stedet for at pipettere hvert reagens separat ned i hver beholder. Prækonfigurerede blandinger er kommercielt tilgængelige, hvor kun prøvespecifikke komponenter (primer) og vand tilsættes. Alternativt kan mastermixen fremstilles selv. I begge varianter fordeles blandingen til hver PCR-beholder uden skabelon, og den individuelle DNA-prøve tilsættes separat til sidst.
Brug af en mastermix har flere fordele: For det første reduceres antallet af enkelte pipetteringstrin. På denne måde minimeres både risikoen for brugerfejl under pipettering og risikoen for kontaminering, og der spares naturligvis tid. I princippet er pipetteringsnøjagtigheden også højere, da der doseres større volumener. Dette er let at forstå, når man kontrollerer pipetternes tekniske data: Jo mindre det doserede volumen er, desto højere kan afvigelserne være. Det faktum, at alle præparater kommer fra den samme beholder, har en positiv effekt på homogeniteten (hvis de er godt blandet). Dette forbedrer også reproducerbarheden af forsøgene.
Ved tilberedning af masterblandingen skal der tilsættes mindst 10 % ekstra volumen (f.eks. hvis der kræves 10 tilberedninger, beregn ud fra 11), så selv den sidste beholder fyldes korrekt. På denne måde kan (små) pipetteringsunøjagtigheder og effekten af prøvetab ved dosering af detergentholdige opløsninger kompenseres. Detergenter findes i enzymopløsninger såsom polymeraser og masterblandinger, hvilket forårsager skumdannelse og rester på den indre overflade af normale...pipettespidser.
Afhængigt af anvendelsen og typen af væske, der skal dispenseres, bør den korrekte pipetteringsteknik (1) vælges, og det passende udstyr bør vælges. Til opløsninger, der indeholder rengøringsmidler, anbefales et direkte fortrængningssystem eller de såkaldte "lavretentions"-pipettespidser som et alternativ til luftpudepipetter. Effekten afACE PIPETTE-spidser baseret på en særlig hydrofob overflade. Væsker, der indeholder rengøringsmidler, efterlader ikke en restfilm på indersiden og ydersiden, så tabet af opløsning kan minimeres.
Udover den nøjagtige dosering af alle komponenter er det også vigtigt, at der ikke sker kontaminering af præparaterne. Det er ikke tilstrækkeligt at bruge forbrugsvarer af høj renhed, da pipetteringsprocessen i en luftpudepipette kan producere aerosoler, der forbliver i pipetten. DNA'et, der kan være indeholdt i aerosolen, kan overføres fra en prøve til den næste i det efterfølgende pipetteringstrin og dermed føre til kontaminering. De ovennævnte direkte fortrængningssystemer kan også minimere denne risiko. For luftpudepipetter giver det mening at bruge filterspidser til at beskytte pipettekeglen ved at tilbageholde stænk, aerosoler og biomolekyler.
Opslagstidspunkt: 6. december 2022