PCR கலவைகளை குழாய் பதிக்கும்போது என்ன கருத்தில் கொள்ள வேண்டும்?

வெற்றிகரமான பெருக்க வினைகளுக்கு, ஒவ்வொரு தயாரிப்பிலும் தனிப்பட்ட வினை கூறுகள் சரியான செறிவில் இருப்பது அவசியம். கூடுதலாக, எந்த மாசுபாடும் ஏற்படாமல் இருப்பது முக்கியம்.

குறிப்பாக பல வினைகளை அமைக்க வேண்டியிருக்கும் போது, ​​ஒவ்வொரு பாத்திரத்திலும் ஒவ்வொரு வினையாக்கியையும் தனித்தனியாக குழாய் பதிப்பதற்கு பதிலாக, மாஸ்டர் கலவை என்று அழைக்கப்படும் ஒன்றைத் தயாரிப்பது நிறுவப்பட்டுள்ளது. முன்-கட்டமைக்கப்பட்ட கலவைகள் வணிக ரீதியாகக் கிடைக்கின்றன, இதில் மாதிரி-குறிப்பிட்ட கூறுகள் (ப்ரைமர்) மற்றும் தண்ணீர் மட்டுமே சேர்க்கப்படுகின்றன. மாற்றாக, மாஸ்டர் கலவையை நீங்களே தயாரிக்கலாம். இரண்டு வகைகளிலும், கலவை ஒவ்வொரு PCR பாத்திரத்திற்கும் ஒரு டெம்ப்ளேட் இல்லாமல் விநியோகிக்கப்படுகிறது மற்றும் தனிப்பட்ட DNA மாதிரி இறுதியில் தனித்தனியாக சேர்க்கப்படுகிறது.

முதன்மை கலவையைப் பயன்படுத்துவது பல நன்மைகளைக் கொண்டுள்ளது: முதலாவதாக, ஒற்றை குழாய் பதிக்கும் படிகளின் எண்ணிக்கை குறைக்கப்படுகிறது. இந்த வழியில், குழாய் பதிக்கும் போது பயனர் பிழைகள் ஏற்படும் அபாயம் மற்றும் மாசுபடுவதற்கான ஆபத்து இரண்டும் குறைக்கப்படுகின்றன, மேலும், நிச்சயமாக, நேரம் மிச்சப்படுத்தப்படுகிறது. கொள்கையளவில், பெரிய அளவுகள் அளவிடப்படுவதால், குழாய் பதிக்கும் துல்லியமும் அதிகமாக உள்ளது. குழாய்களின் தொழில்நுட்பத் தரவைச் சரிபார்க்கும்போது இதைப் புரிந்துகொள்வது எளிது: அளவிடப்பட்ட அளவு சிறியதாக இருந்தால், விலகல்கள் அதிகமாக இருக்கலாம். அனைத்து தயாரிப்புகளும் ஒரே பாத்திரத்திலிருந்து வருகின்றன என்பது ஒருமைப்பாட்டில் நேர்மறையான விளைவைக் கொண்டிருக்கிறது (நன்கு கலந்திருந்தால்). இது சோதனைகளின் மறுஉருவாக்கத்தையும் மேம்படுத்துகிறது.

மாஸ்டர் கலவையைத் தயாரிக்கும் போது, ​​குறைந்தபட்சம் 10% கூடுதல் அளவைச் சேர்க்க வேண்டும் (எ.கா. 10 தயாரிப்புகள் தேவைப்பட்டால், 11 இன் அடிப்படையில் கணக்கிடுங்கள்), இதனால் கடைசி பாத்திரம் கூட சரியாக நிரப்பப்படும். இந்த வழியில், (சிறிதளவு) குழாய் பதிக்கும் தவறுகள் மற்றும் சோப்பு கொண்ட கரைசல்களை அளவிடும்போது மாதிரி இழப்பின் விளைவை ஈடுசெய்ய முடியும். பாலிமரேஸ்கள் மற்றும் மாஸ்டர் கலவைகள் போன்ற நொதி கரைசல்களில் சவர்க்காரங்கள் உள்ளன, இதனால் நுரை உருவாக்கம் மற்றும் சாதாரண கலவையின் உள் மேற்பரப்பில் எச்சங்கள் ஏற்படுகின்றன.பைப்பெட் முனைகள்.

பயன்பாடு மற்றும் விநியோகிக்கப்படும் திரவ வகையைப் பொறுத்து, சரியான குழாய் பதிக்கும் நுட்பம் (1) தேர்ந்தெடுக்கப்பட வேண்டும் மற்றும் பொருத்தமான உபகரணங்களைத் தேர்ந்தெடுக்க வேண்டும். சவர்க்காரங்களைக் கொண்ட கரைசல்களுக்கு, நேரடி இடப்பெயர்ச்சி அமைப்பு அல்லது காற்று-குஷன் பைப்பெட்டுகளுக்கு மாற்றாக "குறைந்த தக்கவைப்பு" பைப்பெட் முனைகள் பரிந்துரைக்கப்படுகின்றன. விளைவுஏஸ் பைப்பெட் முனைகுறிப்பாக நீர்வெறுப்புத் தன்மை கொண்ட மேற்பரப்பை அடிப்படையாகக் கொண்டது. சவர்க்காரங்களைக் கொண்ட திரவங்கள் உள்ளேயும் வெளியேயும் ஒரு எச்சம் படலத்தை விட்டுச் செல்வதில்லை, இதனால் கரைசலின் இழப்பைக் குறைக்க முடியும்.

அனைத்து கூறுகளின் சரியான அளவைத் தவிர, தயாரிப்புகளில் எந்த மாசுபாடும் ஏற்படாமல் இருப்பதும் முக்கியம். அதிக தூய்மையான நுகர்பொருட்களைப் பயன்படுத்துவது போதாது, ஏனெனில் காற்று மெத்தை பைப்பட்டில் பைப்பேட்டிங் செயல்முறை பைப்பேட்டில் இருக்கும் ஏரோசோல்களை உருவாக்க முடியும். ஏரோசோலில் இருக்கக்கூடிய டிஎன்ஏவை பின்வரும் பைப்பேட்டிங் படியில் ஒரு மாதிரியிலிருந்து அடுத்த மாதிரிக்கு மாற்றலாம், இதனால் மாசுபடுவதற்கு வழிவகுக்கும். மேலே குறிப்பிடப்பட்டுள்ள நேரடி இடப்பெயர்ச்சி அமைப்புகளும் இந்த ஆபத்தைக் குறைக்கலாம். காற்று-மெத்தை பைப்பேட்டுகளுக்கு, ஸ்பிளாஸ்கள், ஏரோசோல்கள் மற்றும் உயிர் மூலக்கூறுகளைத் தக்கவைத்துக்கொள்வதன் மூலம் பைப்பேட் கூம்பைப் பாதுகாக்க வடிகட்டி முனைகளைப் பயன்படுத்துவது அர்த்தமுள்ளதாக இருக்கும்.