För framgångsrika amplifieringsreaktioner är det nödvändigt att de enskilda reaktionskomponenterna finns i rätt koncentration i varje beredning. Dessutom är det viktigt att ingen kontaminering uppstår.
Speciellt när många reaktioner måste ställas in har det etablerats att bereda en så kallad mastermix istället för att pipettera varje reagens separat i varje kärl. Förkonfigurerade blandningar finns kommersiellt tillgängliga, där endast provspecifika komponenter (primer) och vatten tillsätts. Alternativt kan mastermixen beredas själv. I båda varianterna distribueras blandningen till varje PCR-kärl utan mall och det individuella DNA-provet tillsätts separat i slutet.
Att använda en mastermix har flera fördelar: För det första minskas antalet enskilda pipetteringssteg. På så sätt minimeras både risken för användarfel vid pipettering och risken för kontaminering, och naturligtvis sparas tid. I princip är pipetteringsnoggrannheten också högre eftersom större volymer doseras. Detta är lätt att förstå när man kontrollerar pipetternas tekniska data: Ju mindre doserad volym, desto högre kan avvikelserna vara. Det faktum att alla preparat kommer från samma kärl har en positiv effekt på homogeniteten (om de är väl blandade). Detta förbättrar också experimentens reproducerbarhet.
Vid beredning av mastermixen bör minst 10 % extra volym tillsättas (t.ex. om 10 beredningar krävs, beräkna utifrån 11), så att även det sista kärlet fylls ordentligt. På så sätt kan (små) pipetteringsfelaktigheter och effekten av provförlust vid dosering av rengöringsmedelshaltiga lösningar kompenseras. Rengöringsmedel finns i enzymlösningar som polymeraser och mastermixar, vilket orsakar skumbildning och rester på insidan av normala lösningar.pipettspetsar.
Beroende på tillämpning och vilken typ av vätska som ska dispenseras bör rätt pipetteringsteknik (1) väljas och lämplig utrustning väljas. För lösningar som innehåller rengöringsmedel rekommenderas ett direktförträngningssystem eller så kallade pipettspetsar med "låg retention" som ett alternativ till luftkuddepipetter. Effekten avACE-PIPETTSPETSär baserad på en särskilt hydrofob yta. Vätskor som innehåller rengöringsmedel lämnar ingen restfilm på insidan eller utsidan, så att lösningsförlusten kan minimeras.
Förutom exakt dosering av alla komponenter är det också viktigt att ingen kontaminering av preparaten sker. Det räcker inte att använda förbrukningsmaterial med hög renhet, eftersom pipetteringsprocessen i en luftkuddepipett kan producera aerosoler som stannar kvar i pipetten. DNA:t som kan finnas i aerosolen kan överföras från ett prov till nästa i följande pipetteringssteg och därmed leda till kontaminering. De direkta förträngningssystem som nämns ovan kan också minimera denna risk. För luftkuddepipetter är det klokt att använda filterspetsar för att skydda pipettkonen genom att hålla tillbaka stänk, aerosoler och biomolekyler.
Publiceringstid: 6 december 2022