За успешне реакције амплификације, неопходно је да појединачне компоненте реакције буду присутне у исправној концентрацији у сваком препарату. Поред тога, важно је да не дође до контаминације.
Посебно када је потребно подесити много реакција, установљено је да се припрема такозвана мастер мешавина уместо пипетирања сваког реагенса засебно у сваку посуду. Комерцијално су доступне унапред конфигурисане мешавине у које се додају само компоненте специфичне за узорак (прајмер) и вода. Алтернативно, мастер мешавину можете припремити сами. У обе варијанте, смеша се дистрибуира у сваку PCR посуду без шаблона, а појединачни узорак ДНК се додаје засебно на крају.
Коришћење мастер микса има неколико предности: Прво, смањује се број појединачних корака пипетирања. На овај начин се минимизира и ризик од грешака корисника током пипетирања и ризик од контаминације и, наравно, штеди се време. У принципу, тачност пипетирања је такође већа, јер се дозирају веће запремине. Ово је лако разумети приликом провере техничких података пипета: Што је мања дозирана запремина, већа могу бити одступања. Чињеница да сви препарати долазе из исте посуде позитивно утиче на хомогеност (ако се добро измеша). Ово такође побољшава поновљивост експеримената.
Приликом припреме мастер микса, треба додати најмање 10% додатне запремине (нпр. ако је потребно 10 припрема, рачунати на основу 11), тако да се и последња посуда правилно напуни. На овај начин се могу компензовати (мале) нетачности пипетирања и ефекат губитка узорка при дозирању раствора који садрже детерџент. Детерџенти се налазе у растворима ензима као што су полимеразе и мастер миксеви, што узрокује стварање пене и остатака на унутрашњој површини нормалних...врхови пипета.
У зависности од примене и врсте течности која се дозира, треба одабрати исправну технику пипетирања (1) и одговарајућу опрему. За растворе који садрже детерџенте, препоручује се систем директног истискивања или такозвани врхови пипета „ниског задржавања“ као алтернатива за пипете са ваздушним јастуком. ЕфекатВрх за АЦЕ пипетубазиран је на посебно хидрофобној површини. Течности које садрже детерџенте не остављају филм остатака са унутрашње и спољашње стране, тако да се губитак раствора може свести на минимум.
Поред прецизног дозирања свих компоненти, важно је и да не дође до контаминације препарата. Није довољно користити потрошни материјал високе чистоће, јер процес пипетирања у пипети са ваздушним јастуком може произвести аеросоле који остају у пипети. ДНК која може бити садржана у аеросолу може се пренети из једног узорка у други у следећем кораку пипетирања и тако довести до контаминације. Горе поменути системи за директно истискивање такође могу минимизирати овај ризик. За пипете са ваздушним јастуком има смисла користити филтерске врхове како би се заштитио конус пипете задржавањем прскања, аеросола и биомолекула.
Време објаве: 06.12.2022.