Для успешного проведения реакций амплификации необходимо, чтобы отдельные компоненты реакции присутствовали в правильной концентрации в каждом препарате. Кроме того, важно, чтобы не происходило загрязнения.
Особенно когда необходимо настроить много реакций, было установлено, что нужно готовить так называемую мастер-микс вместо того, чтобы пипетировать каждый реагент отдельно в каждый сосуд. В продаже имеются предварительно сконфигурированные смеси, в которые добавляются только компоненты, специфичные для образца (праймер) и вода. В качестве альтернативы мастер-микс можно приготовить самостоятельно. В обоих вариантах смесь распределяется по каждому сосуду ПЦР без матрицы, а индивидуальный образец ДНК добавляется отдельно в конце.
Использование мастер-микса имеет несколько преимуществ: Во-первых, сокращается количество отдельных этапов пипетирования. Таким образом, как риск ошибок пользователя во время пипетирования, так и риск загрязнения сводятся к минимуму и, конечно, экономится время. В принципе, точность пипетирования также выше, поскольку дозируются большие объемы. Это легко понять при проверке технических данных пипеток: чем меньше дозируемый объем, тем выше могут быть отклонения. Тот факт, что все препараты поступают из одного сосуда, положительно влияет на однородность (при хорошем перемешивании). Это также улучшает воспроизводимость экспериментов.
При приготовлении мастер-микса следует добавить не менее 10% дополнительного объема (например, если требуется 10 приготовлений, рассчитывайте на основе 11), чтобы даже последний сосуд был заполнен должным образом. Таким образом, (небольшие) неточности пипетирования и эффект потери образца при дозировании растворов, содержащих детергенты, могут быть компенсированы. Детергенты содержатся в ферментных растворах, таких как полимеразы и мастер-миксы, вызывая образование пены и остатков на внутренней поверхности обычныхнаконечники пипеток.
В зависимости от области применения и типа дозируемой жидкости следует выбрать правильную технику пипетирования (1) и соответствующее оборудование. Для растворов, содержащих детергенты, рекомендуется использовать систему прямого вытеснения или так называемые наконечники пипеток «с низким удержанием» в качестве альтернативы пипеткам с воздушной подушкой. Эффектнаконечник пипетки ACEоснован на особо гидрофобной поверхности. Жидкости, содержащие моющие средства, не оставляют пленки остатков внутри и снаружи, так что потери раствора могут быть сведены к минимуму.
Помимо точного дозирования всех компонентов, также важно, чтобы не происходило загрязнения препаратов. Недостаточно использовать расходные материалы высокой чистоты, поскольку процесс пипетирования в пипетке с воздушной подушкой может производить аэрозоли, которые остаются в пипетке. ДНК, которая может содержаться в аэрозоле, может быть перенесена из одного образца в другой на следующем этапе пипетирования и, таким образом, привести к загрязнению. Системы прямого вытеснения, упомянутые выше, также могут минимизировать этот риск. Для пипеток с воздушной подушкой имеет смысл использовать фильтрующие наконечники для защиты конуса пипетки путем удержания брызг, аэрозолей и биомолекул.
Время публикации: 06.12.2022