Para que as reações de amplificação sejam bem-sucedidas, é necessário que os componentes individuais da reação estejam presentes na concentração correta em cada preparação. Além disso, é importante que não haja contaminação.
Especialmente quando é necessário preparar muitas reações, optou-se por preparar uma chamada mistura mestre em vez de pipetar cada reagente separadamente em cada recipiente. Misturas pré-configuradas estão disponíveis comercialmente, nas quais são adicionados apenas componentes específicos da amostra (primer) e água. Alternativamente, a mistura mestre pode ser preparada por você. Em ambas as variantes, a mistura é distribuída para cada recipiente de PCR sem molde e a amostra individual de DNA é adicionada separadamente ao final.
Utilizar uma mistura mestre apresenta várias vantagens: primeiro, o número de etapas de pipetagem única é reduzido. Dessa forma, tanto o risco de erros do usuário durante a pipetagem quanto o risco de contaminação são minimizados e, naturalmente, economiza-se tempo. Em princípio, a precisão da pipetagem também é maior, pois volumes maiores são dosados. Isso é fácil de entender ao verificar os dados técnicos das pipetas: quanto menor o volume dosado, maiores podem ser os desvios. O fato de todas as preparações serem provenientes do mesmo recipiente tem um efeito positivo na homogeneidade (se bem misturadas). Isso também melhora a reprodutibilidade dos experimentos.
Ao preparar a mistura principal, deve-se adicionar pelo menos 10% de volume extra (por exemplo, se forem necessárias 10 preparações, calcule com base em 11), para que até mesmo o último recipiente seja preenchido corretamente. Desta forma, (pequenas) imprecisões de pipetagem e o efeito da perda de amostra ao dosar soluções contendo detergente podem ser compensados. Detergentes estão presentes em soluções enzimáticas, como polimerases e misturas principais, causando formação de espuma e resíduos na superfície interna de soluções normais.pontas de pipeta.
Dependendo da aplicação e do tipo de líquido a ser dispensado, deve-se escolher a técnica de pipetagem correta (1) e selecionar o equipamento apropriado. Para soluções contendo detergentes, recomenda-se um sistema de deslocamento direto ou as chamadas ponteiras de “baixa retenção” como alternativa às pipetas de colchão de ar. O efeito dePonta de pipeta ACEBaseia-se em uma superfície particularmente hidrofóbica. Líquidos que contêm detergentes não deixam película residual interna e externamente, minimizando a perda de solução.
Além da dosagem exata de todos os componentes, também é importante que não ocorra contaminação das preparações. Não é suficiente utilizar consumíveis de alta pureza, pois o processo de pipetagem em uma pipeta com almofada de ar pode produzir aerossóis que permanecem na pipeta. O DNA que pode estar contido no aerossol pode ser transferido de uma amostra para outra na etapa de pipetagem seguinte, levando à contaminação. Os sistemas de deslocamento direto mencionados acima também podem minimizar esse risco. Para pipetas com almofada de ar, faz sentido usar pontas com filtro para proteger o cone da pipeta, retendo respingos, aerossóis e biomoléculas.
Horário da publicação: 06/12/2022