Aby reakcje amplifikacji zakończyły się sukcesem, konieczne jest, aby poszczególne składniki reakcji były obecne w odpowiednim stężeniu w każdym preparacie. Ponadto ważne jest, aby nie doszło do zanieczyszczenia.
Zwłaszcza gdy trzeba przygotować wiele reakcji, ustalono, że należy przygotować tzw. master mix zamiast pipetować każdy odczynnik osobno do każdego naczynia. Wstępnie skonfigurowane mieszanki są dostępne w handlu, w których dodaje się tylko składniki specyficzne dla próbki (primer) i wodę. Alternatywnie master mix można przygotować samodzielnie. W obu wariantach mieszanina jest rozprowadzana do każdego naczynia PCR bez szablonu, a indywidualna próbka DNA jest dodawana osobno na końcu.
Użycie mieszanki master mix ma kilka zalet: Po pierwsze, liczba pojedynczych kroków pipetowania jest zmniejszona. W ten sposób ryzyko błędów użytkownika podczas pipetowania i ryzyko zanieczyszczenia są zminimalizowane, a oczywiście oszczędza się czas. Zasadniczo dokładność pipetowania jest również wyższa, ponieważ dozowane są większe objętości. Łatwo to zrozumieć, sprawdzając dane techniczne pipet: im mniejsza dozowana objętość, tym większe mogą być odchylenia. Fakt, że wszystkie preparaty pochodzą z tego samego naczynia, ma pozytywny wpływ na jednorodność (jeśli są dobrze wymieszane). Poprawia to również powtarzalność eksperymentów.
Podczas przygotowywania mieszanki głównej należy dodać co najmniej 10% dodatkowej objętości (np. jeśli wymaganych jest 10 preparatów, należy obliczyć na podstawie 11), aby nawet ostatnie naczynie zostało prawidłowo napełnione. W ten sposób można zrekompensować (nieznaczne) niedokładności pipetowania i wpływ utraty próbki podczas dozowania roztworów zawierających detergent. Detergenty są zawarte w roztworach enzymów, takich jak polimerazy i mieszanki główne, powodując tworzenie się piany i pozostałości na wewnętrznej powierzchni normalnychkońcówki pipet.
W zależności od zastosowania i rodzaju dozowanej cieczy należy wybrać właściwą technikę pipetowania (1) i odpowiedni sprzęt. W przypadku roztworów zawierających detergenty zaleca się stosowanie systemu bezpośredniego wyporu lub końcówek pipet o tzw. „niskiej retencji” jako alternatywy dla pipet z poduszką powietrzną. EfektKońcówka do pipety ACEopiera się na szczególnie hydrofobowej powierzchni. Płyny zawierające detergenty nie pozostawiają resztkowej warstwy wewnątrz i na zewnątrz, dzięki czemu można zminimalizować utratę roztworu.
Oprócz dokładnego dozowania wszystkich składników, ważne jest również, aby nie doszło do zanieczyszczenia preparatów. Nie wystarczy używać materiałów eksploatacyjnych o wysokiej czystości, ponieważ proces pipetowania w pipecie z poduszką powietrzną może wytwarzać aerozole, które pozostają w pipecie. DNA, które może być zawarte w aerozolu, może zostać przeniesione z jednej próbki do drugiej w kolejnym etapie pipetowania, co może prowadzić do zanieczyszczenia. Wymienione powyżej systemy bezpośredniego przemieszczania mogą również zminimalizować to ryzyko. W przypadku pipet z poduszką powietrzną ma sens stosowanie końcówek z filtrem w celu ochrony stożka pipety poprzez zatrzymywanie rozprysków, aerozoli i biocząsteczek.
Czas publikacji: 06-12-2022