Voor succesvolle amplificatiereacties is het noodzakelijk dat de afzonderlijke reactiecomponenten in de juiste concentratie in elk preparaat aanwezig zijn. Daarnaast is het belangrijk dat er geen contaminatie optreedt.
Vooral wanneer er veel reacties moeten worden opgezet, is het gebruikelijk om een zogenaamde mastermix te bereiden in plaats van elk reagens apart in elk vat te pipetteren. Er zijn kant-en-klare mixen verkrijgbaar, waaraan alleen monsterspecifieke componenten (primer) en water worden toegevoegd. Als alternatief kunt u de mastermix ook zelf bereiden. In beide varianten wordt het mengsel zonder template over elk PCR-vat verdeeld en wordt het individuele DNA-monster aan het einde apart toegevoegd.
Het gebruik van een mastermix heeft verschillende voordelen: Ten eerste wordt het aantal individuele pipetteerstappen verminderd. Dit minimaliseert zowel de kans op gebruikersfouten tijdens het pipetteren als het risico op contaminatie en bespaart uiteraard tijd. In principe is de pipetteernauwkeurigheid ook hoger, omdat er grotere volumes worden gedoseerd. Dit is gemakkelijk te begrijpen bij het controleren van de technische gegevens van pipetten: hoe kleiner het gedoseerde volume, hoe groter de afwijkingen kunnen zijn. Het feit dat alle preparaten uit hetzelfde vat komen, heeft een positief effect op de homogeniteit (mits goed gemengd). Dit verbetert ook de reproduceerbaarheid van de experimenten.
Bij het bereiden van de mastermix moet minimaal 10% extra volume worden toegevoegd (bijv. als er 10 preparaten nodig zijn, reken dan op basis van 11), zodat ook het laatste vat goed gevuld is. Op deze manier kunnen (kleine) pipetteeronnauwkeurigheden en het effect van monsterverlies bij het doseren van detergenthoudende oplossingen worden gecompenseerd. Detergenten zitten in enzymoplossingen zoals polymerasen en mastermixen, waardoor schuimvorming en resten aan de binnenkant van normale vloeistoffen ontstaan.pipetpunten.
Afhankelijk van de toepassing en het type vloeistof dat moet worden gedoseerd, moet de juiste pipetteertechniek (1) worden gekozen en de juiste apparatuur worden geselecteerd. Voor oplossingen die detergenten bevatten, worden een direct-dumpsysteem of de zogenaamde "low retention" pipetpunten als alternatief voor luchtkussenpipetten aanbevolen. Het effect vanACE PIPET tipis gebaseerd op een bijzonder hydrofoob oppervlak. Vloeistoffen met detergenten laten geen residulaagje achter aan de binnen- en buitenkant, waardoor het verlies van oplossing tot een minimum beperkt blijft.
Naast de exacte dosering van alle componenten is het ook belangrijk dat er geen contaminatie van de preparaten optreedt. Het is niet voldoende om verbruiksartikelen met een hoge zuiverheid te gebruiken, omdat het pipetteerproces in een luchtkussenpipet aerosolen kan produceren die in de pipet achterblijven. Het DNA dat zich mogelijk in de aerosol bevindt, kan in de volgende pipetteerstap van het ene monster naar het andere worden overgebracht en zo tot contaminatie leiden. De hierboven genoemde directe verdringingssystemen kunnen dit risico ook minimaliseren. Bij luchtkussenpipetten is het zinvol om filtertips te gebruiken om de pipetkegel te beschermen tegen spatten, aerosolen en biomoleculen.
Plaatsingstijd: 6 dec. 2022