Lai amplifikācijas reakcijas būtu veiksmīgas, ir nepieciešams, lai katrā preparātā atsevišķie reakcijas komponenti būtu pareizā koncentrācijā. Turklāt ir svarīgi, lai nerastos piesārņojums.
Īpaši, ja ir jāiestata daudzas reakcijas, ir ierasts sagatavot tā saukto galveno maisījumu, nevis katru reaģentu atsevišķi pipetēt katrā traukā. Ir pieejami iepriekš konfigurēti maisījumi, kuros pievieno tikai paraugam specifiskas sastāvdaļas (primeri) un ūdeni. Alternatīvi, galveno maisījumu var sagatavot pats. Abos variantos maisījums tiek sadalīts katrā PCR traukā bez veidnes, un atsevišķais DNS paraugs tiek pievienots atsevišķi beigās.
Izmantojot galveno maisījumu, ir vairākas priekšrocības: Pirmkārt, tiek samazināts atsevišķu pipetēšanas soļu skaits. Tādā veidā tiek samazināts gan lietotāja kļūdu risks pipetēšanas laikā, gan piesārņojuma risks un, protams, tiek ietaupīts laiks. Principā arī pipetēšanas precizitāte ir augstāka, jo tiek dozēti lielāki tilpumi. To ir viegli saprast, pārbaudot pipešu tehniskos datus: jo mazāks ir dozētais tilpums, jo lielākas var būt novirzes. Fakts, ka visi preparāti nāk no viena trauka, pozitīvi ietekmē homogenitāti (ja tie ir labi sajaukti). Tas arī uzlabo eksperimentu reproducējamību.
Sagatavojot pamatmaisījumu, jāpievieno vismaz 10 % papildu tilpuma (piemēram, ja nepieciešami 10 preparāti, aprēķini jāveic, pamatojoties uz 11), lai pat pēdējais trauks būtu pareizi piepildīts. Tādā veidā var kompensēt (nelielas) pipetēšanas neprecizitātes un parauga zuduma ietekmi, dozējot mazgāšanas līdzekļus saturošus šķīdumus. Mazgāšanas līdzekļi ir atrodami enzīmu šķīdumos, piemēram, polimerāzēs un pamatmaisījumos, izraisot putu un nogulšņu veidošanos uz normālas iekšējās virsmas.pipetes uzgaļi.
Atkarībā no pielietojuma un ievadāmā šķidruma veida jāizvēlas pareiza pipetēšanas tehnika (1) un atbilstošs aprīkojums. Šķīdumiem, kas satur mazgāšanas līdzekļus, ieteicams izmantot tiešās pārvietošanas sistēmu vai tā sauktos "zemas aiztures" pipešu uzgaļus kā alternatīvu gaisa spilvenu pipetēm. Ietekme uzACE PIPETES uzgalisir balstīts uz īpaši hidrofobu virsmu. Šķidrumi, kas satur mazgāšanas līdzekļus, neatstāj nosēdumu plēvīti ne iekšpusē, ne ārpusē, tāpēc šķīduma zudumus var samazināt līdz minimumam.
Papildus precīzai visu komponentu dozēšanai ir svarīgi arī nepieļaut preparātu piesārņošanu. Nepietiek tikai ar augstas tīrības pakāpes palīgmateriālu izmantošanu, jo pipetēšanas process gaisa spilvena pipetē var radīt aerosolus, kas paliek pipetē. DNS, kas var būt aerosolā, nākamajā pipetēšanas posmā var tikt pārnesta no viena parauga uz nākamo un tādējādi izraisīt piesārņojumu. Iepriekš minētās tiešās pārvietošanas sistēmas var arī samazināt šo risku. Gaisa spilvena pipetēm ir lietderīgi izmantot filtra uzgaļus, lai aizsargātu pipetes konusu, aizturot šļakatas, aerosolus un biomolekulas.
Publicēšanas laiks: 2022. gada 6. decembris