Sėkmingoms amplifikacijos reakcijoms būtina, kad kiekviename preparate būtų tinkama atskirų reakcijos komponentų koncentracija. Be to, svarbu, kad nebūtų užteršimo.
Ypač kai reikia paruošti daug reakcijų, įprasta paruošti vadinamąjį pagrindinį mišinį, o ne kiekvieną reagentą atskirai pipete įlašinti į kiekvieną indą. Komerciniu būdu galima įsigyti iš anksto sukonfigūruotų mišinių, į kuriuos dedami tik mėginiui būdingi komponentai (pradmuo) ir vanduo. Arba pagrindinį mišinį galima paruošti patiems. Abiem atvejais mišinys paskirstomas į kiekvieną PGR indą be šablono, o atskiras DNR mėginys pridedamas atskirai pabaigoje.
Pagrindinio mišinio naudojimas turi keletą privalumų: pirma, sumažinamas vienkartinių pipetės etapų skaičius. Tokiu būdu sumažinama tiek naudotojo klaidų pipetės metu, tiek užteršimo rizika ir, žinoma, sutaupoma laiko. Iš esmės pipetės tikslumas taip pat yra didesnis, nes dozuojami didesni tūriai. Tai lengva suprasti patikrinus pipečių techninius duomenis: kuo mažesnis dozuojamas tūris, tuo didesni gali būti nuokrypiai. Tai, kad visi preparatai yra iš to paties indo, teigiamai veikia homogeniškumą (jei gerai sumaišyti). Tai taip pat pagerina eksperimentų atkuriamumą.
Ruošiant pagrindinį mišinį, reikia pridėti bent 10 % papildomo tūrio (pvz., jei reikia 10 paruošimų, skaičiuokite pagal 11), kad net ir paskutinis indas būtų tinkamai užpildytas. Tokiu būdu galima kompensuoti (nedidelius) pipetės netikslumus ir mėginio nuostolių poveikį dozuojant ploviklių turinčius tirpalus. Ploviklių yra fermentų tirpaluose, tokiuose kaip polimerazės ir pagrindiniai mišiniai, todėl ant normalių indų vidinio paviršiaus susidaro putos ir likučiai.pipetės antgaliai.
Priklausomai nuo naudojimo ir skysčio tipo, reikia pasirinkti tinkamą pipetės techniką (1) ir tinkamą įrangą. Tirpalams, kurių sudėtyje yra ploviklių, rekomenduojama naudoti tiesioginio išstūmimo sistemą arba vadinamuosius „mažo sulaikymo“ pipetės antgalius kaip alternatyvą oro pagalvėms.ACE pipetės antgalisyra pagrįstas ypač hidrofobiniu paviršiumi. Skysčiai, kurių sudėtyje yra ploviklių, nepalieka likučių plėvelės viduje ir išorėje, todėl tirpalo nuostoliai gali būti sumažinti iki minimumo.
Be tikslaus visų komponentų dozavimo, taip pat svarbu užtikrinti, kad preparatai nebūtų užteršti. Nepakanka naudoti vien labai grynas eksploatacines medžiagas, nes pipetės gamybos metu oro pagalvėje gali susidaryti aerozoliai, kurie lieka pipetėje. Aerozolyje esanti DNR kitame pipetės gamybos etape gali būti perkelta iš vieno mėginio į kitą ir taip sukelti užteršimą. Aukščiau paminėtos tiesioginio išstūmimo sistemos taip pat gali sumažinti šią riziką. Oro pagalvėje esančioms pipetėms prasminga naudoti filtro antgalius, kad apsaugotumėte pipetės kūgį, sulaikydami purslus, aerozolius ir biomolekules.
Įrašo laikas: 2022 m. gruodžio 6 d.