Le reazioni a catena della polimerasi (PCR) sono uno dei metodi più noti utilizzati nei laboratori di scienze della vita.
Le piastre PCR sono realizzate in materie plastiche di prima qualità, per un'eccellente elaborazione e analisi dei campioni o dei risultati raccolti.
Hanno pareti sottili e omogenee per garantire un trasferimento termico preciso.
Per prepararsi alle applicazioni in tempo reale, piccole sezioni di DNA o RNA vengono isolate e conservate in piastre PCR.
Le piastre PCR sono molto efficienti nella termosaldatura e limitano anche il flusso di calore.
Tuttavia, nonostante l'efficacia e l'affidabilità delle piastre PCR, errori e imprecisioni si insinuano facilmente durante l'elaborazione dei campioni.
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Ecco alcune precauzioni da seguire per evitare contaminazioni dei reagenti o dei campioni e impedire che imprecisioni si insinuino nei risultati.
Sterilizzazione dell'ambiente circostante
Risultati positivi o negativi errati si verificano a causa della presenza di impurità, che fanno dubitare dei risultati.
Le impurità e i contaminanti si presentano in varie forme, come DNA non correlato o additivi chimici, che finiscono per ridurre l'efficienza e l'efficacia della reazione.
Esistono numerosi modi per ridurre notevolmente il tasso di contaminazione della piastra PCR.
Un altro metodo utile per impedire che le impurità si introducano nei campioni attraverso le pipette è utilizzare punte con filtro sterilizzate.
Dedicare un set di attrezzature completamente pulito, composto da pipette e rack, esclusivamente all'uso della PCR. Ciò garantirà un trasferimento trascurabile di impurità o contaminanti all'interno del laboratorio.
Utilizzare candeggina ed etanolo sulle pipette, sui rack e sui banchi per eliminare i contaminanti.
Assegna uno spazio riservato a tutte le tue reazioni PCR per ridurre ulteriormente la contaminazione da particelle.
Utilizzare guanti puliti a ogni passaggio e sostituirli frequentemente.
Piastre PCR
Controllare la concentrazione e la purezza del modello.
È necessario mantenere la pulizia del banco di lavoro e delle attrezzature utilizzate durante l'analisi dei campioni con la PCR. È essenziale convalidare il grado di purezza dei campioni prima dell'analisi e del trattamento.
In genere, gli analizzatori prendono in considerazione la concentrazione e il livello di purezza dei campioni di DNA.
Il rapporto di assorbanza per 260 nm/280 nm non deve essere inferiore a 1,8. Le lunghezze d'onda successive, comprese tra 230 nm e 320 nm, vengono utilizzate per identificare le impurità.
Ad esempio, i sali caotropici e altri composti organici vengono rilevati a una velocità di assorbanza di 230 nm. Anche la torbidità nei campioni di DNA viene rilevata e verificata a una velocità di assorbanza di 320 nm.
Evitare di sovraccaricare le piastre PCR con il prodotto
Nonostante si desideri analizzare più prodotti contemporaneamente, si verifica una contaminazione incrociata delle piastre PCR.
Sovraccaricare le piastre PCR con prodotti diversi crea sprechi e rende estremamente difficile l'identificazione dei campioni.
Conservare i registri dei reagenti PCR aliquoti
Cicli continui di congelamento/scongelamento e l'uso frequente di aliquote potrebbero danneggiare i reagenti PCR, gli enzimi e i DNTP attraverso la ricristallizzazione.
Cercare sempre di monitorare la velocità di aliquota utilizzata durante la preparazione dei campioni da analizzare.
Il LIMS preferibile è più adatto a controllare l'inventario e la quantità di reagenti e campioni congelati o scongelati.
Scegliere la temperatura di ricottura migliore.
Un altro modo per cui i risultati della PCR contengono errori è scegliere e utilizzare una temperatura di ricottura errata.
A volte, la reazione non procede come previsto. È opportuno ridurre la temperatura di ricottura per favorire il successo della reazione.
Tuttavia, abbassando la temperatura aumentano le possibilità di falsi positivi e di comparsa di dimeri nei primer.
È importante confermare l'analisi della curva di fusione quando si utilizzano piastre PCR, poiché è un buon indicatore per la selezione della corretta temperatura di ricottura.
Il software di progettazione dei primer facilita la progettazione e fornisce la temperatura di ricottura corretta, riducendo così direttamente gli errori nelle piastre PCR.
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Data di pubblicazione: 30 ottobre 2021