Agar reaksi amplifikasi berhasil, komponen-komponen reaksi individual harus hadir dalam konsentrasi yang tepat dalam setiap sediaan. Selain itu, penting agar tidak terjadi kontaminasi.
Terutama ketika banyak reaksi harus disiapkan, telah ditetapkan untuk menyiapkan apa yang disebut campuran induk alih-alih memipet setiap reagen secara terpisah ke dalam setiap wadah. Campuran yang telah dikonfigurasi sebelumnya tersedia secara komersial, di mana hanya komponen khusus sampel (primer) dan air yang ditambahkan. Atau, campuran induk dapat disiapkan sendiri. Dalam kedua varian, campuran didistribusikan ke setiap wadah PCR tanpa templat dan sampel DNA individual ditambahkan secara terpisah di bagian akhir.
Menggunakan master mix memiliki beberapa keuntungan: Pertama, jumlah langkah pipet tunggal berkurang. Dengan cara ini, risiko kesalahan pengguna selama pemipetan dan risiko kontaminasi diminimalkan dan, tentu saja, menghemat waktu. Pada prinsipnya, akurasi pemipetan juga lebih tinggi, karena volume yang lebih besar ditakar. Ini mudah dipahami saat memeriksa data teknis pipet: Semakin kecil volume yang ditakar, semakin tinggi deviasinya. Fakta bahwa semua sediaan berasal dari wadah yang sama memiliki efek positif pada homogenitas (jika tercampur dengan baik). Ini juga meningkatkan reproduktifitas percobaan.
Saat menyiapkan campuran induk, setidaknya 10% volume ekstra harus ditambahkan (misalnya jika diperlukan 10 persiapan, hitung berdasarkan 11), sehingga bejana terakhir pun terisi dengan benar. Dengan cara ini, ketidakakuratan pemipetan (sedikit), dan efek kehilangan sampel saat menakar larutan yang mengandung deterjen dapat dikompensasi. Deterjen terkandung dalam larutan enzim seperti polimerase dan campuran induk, menyebabkan pembentukan busa dan residu pada permukaan bagian dalam normalujung pipet.
Bergantung pada aplikasi dan jenis cairan yang akan disalurkan, teknik pemipetan yang benar (1) harus dipilih dan peralatan yang sesuai dipilih. Untuk larutan yang mengandung deterjen, sistem pemindahan langsung atau yang disebut ujung pipet “retensi rendah” sebagai alternatif untuk pipet bantalan udara direkomendasikan. EfekUjung PIPET ACEdidasarkan pada permukaan yang sangat hidrofobik. Cairan yang mengandung deterjen tidak meninggalkan lapisan residu di bagian dalam dan luar, sehingga hilangnya larutan dapat diminimalkan.
Selain dosis yang tepat untuk semua komponen, penting juga agar tidak terjadi kontaminasi pada sediaan. Tidak cukup hanya menggunakan bahan habis pakai dengan kemurnian tinggi, karena proses pemipetan pada pipet bantalan udara dapat menghasilkan aerosol yang tertinggal di dalam pipet. DNA yang mungkin terkandung dalam aerosol dapat dipindahkan dari satu sampel ke sampel berikutnya pada langkah pemipetan berikutnya dan dengan demikian menyebabkan kontaminasi. Sistem pemindahan langsung yang disebutkan di atas juga dapat meminimalkan risiko ini. Untuk pipet bantalan udara, masuk akal untuk menggunakan ujung filter guna melindungi kerucut pipet dengan menahan percikan, aerosol, dan biomolekul.
Waktu posting: 06-Des-2022