Za uspješne reakcije amplifikacije potrebno je da pojedinačne komponente reakcije budu prisutne u ispravnoj koncentraciji u svakom pripravku. Osim toga, važno je da ne dođe do kontaminacije.
Pogotovo kada je potrebno postaviti mnogo reakcija, utvrđeno je da se umjesto pipetiranja svakog reagensa zasebno u svaku posudu priprema takozvana glavna smjesa. Komercijalno su dostupne unaprijed konfigurirane smjese u koje se dodaju samo komponente specifične za uzorak (primer) i voda. Alternativno, glavnu smjesu možete pripremiti sami. U obje varijante, smjesa se distribuira u svaku PCR posudu bez predloška, a pojedinačni uzorak DNK dodaje se zasebno na kraju.
Korištenje glavne smjese ima nekoliko prednosti: Prvo, smanjuje se broj pojedinačnih koraka pipetiranja. Na taj se način minimizira i rizik od pogrešaka korisnika tijekom pipetiranja i rizik od kontaminacije, a naravno se štedi i vrijeme. U principu, točnost pipetiranja je također veća, budući da se doziraju veći volumeni. To je lako razumjeti prilikom provjere tehničkih podataka pipeta: Što je manji dozirani volumen, to mogu biti veća odstupanja. Činjenica da svi pripravci dolaze iz iste posude pozitivno utječe na homogenost (ako se dobro promiješa). To također poboljšava ponovljivost eksperimenata.
Prilikom pripreme glavne smjese treba dodati najmanje 10 % dodatnog volumena (npr. ako je potrebno 10 pripravaka, izračunati na temelju 11), tako da se i posljednja posuda pravilno napuni. Na taj se način mogu kompenzirati (male) netočnosti pipetiranja i učinak gubitka uzorka pri doziranju otopina koje sadrže deterdžente. Deterdženti se nalaze u otopinama enzima kao što su polimeraze i glavne smjese, što uzrokuje stvaranje pjene i ostataka na unutarnjoj površini normalnih...vrhovi pipeta.
Ovisno o primjeni i vrsti tekućine koja se dozira, treba odabrati ispravnu tehniku pipetiranja (1) i odabrati odgovarajuću opremu. Za otopine koje sadrže deterdžente preporučuje se sustav izravnog istiskivanja ili takozvani vrhovi pipeta „niskog zadržavanja“ kao alternativa pipetama sa zračnim jastukom. UčinakACE vrh za pipetutemelji se na posebno hidrofobnoj površini. Tekućine koje sadrže deterdžente ne ostavljaju film ostataka s unutarnje i vanjske strane, tako da se gubitak otopine može svesti na minimum.
Osim točnog doziranja svih komponenti, važno je i da ne dođe do kontaminacije pripravaka. Nije dovoljno koristiti potrošni materijal visoke čistoće, jer proces pipetiranja u pipeti sa zračnim jastukom može proizvesti aerosole koji ostaju u pipeti. DNK koja se može nalaziti u aerosolu može se prenijeti iz jednog uzorka u drugi u sljedećem koraku pipetiranja i tako dovesti do kontaminacije. Gore spomenuti sustavi izravnog istiskivanja također mogu smanjiti ovaj rizik. Za pipete sa zračnim jastukom ima smisla koristiti filterske vrhove kako bi se zaštitio konus pipete zadržavanjem prskanja, aerosola i biomolekula.
Vrijeme objave: 06.12.2022.