Onnistuneiden monistusreaktioiden kannalta on välttämätöntä, että yksittäisiä reaktiokomponentteja on läsnä oikeassa pitoisuudessa kussakin valmisteessa. Lisäksi on tärkeää, ettei kontaminaatiota tapahdu.
Erityisesti silloin, kun on järjestettävä useita reaktioita, on vakiintunut tapa valmistaa niin sanottu pääseos sen sijaan, että jokainen reagenssi pipetoidaan erikseen jokaiseen astiaan. Kaupallisesti on saatavilla valmiiksi konfiguroituja seoksia, joihin lisätään vain näytekohtaiset komponentit (aluke) ja vesi. Vaihtoehtoisesti pääseoksen voi valmistaa itse. Molemmissa vaihtoehdoissa seos jaetaan jokaiseen PCR-astiaan ilman templaattia ja yksittäinen DNA-näyte lisätään erikseen lopussa.
Pääseoksen käytöllä on useita etuja: Ensinnäkin yksittäisten pipetointivaiheiden määrä vähenee. Tällä tavoin sekä käyttäjän virheiden riski pipetoinnin aikana että kontaminaatioriski minimoituvat ja luonnollisesti myös aikaa säästyy. Periaatteessa pipetointitarkkuus on myös parempi, koska annostellaan suurempia tilavuuksia. Tämä on helppo ymmärtää pipettien teknisiä tietoja tarkistaessa: Mitä pienempi annosteltu tilavuus on, sitä suurempia poikkeamat voivat olla. Sillä, että kaikki valmisteet tulevat samasta astiasta, on positiivinen vaikutus homogeenisuuteen (jos ne on sekoitettu hyvin). Tämä parantaa myös kokeiden toistettavuutta.
Pääseosta valmistettaessa on lisättävä vähintään 10 % ylimääräistä tilavuutta (esim. jos tarvitaan 10 valmistusta, laske 11:n perusteella), jotta viimeinenkin astia täyttyy oikein. Tällä tavoin voidaan kompensoida (pieniä) pipetointiepätarkkuuksia ja näytehävikin vaikutusta pesuainetta sisältävien liuosten annostelussa. Pesuaineita on entsyymiliuoksissa, kuten polymeraaseissa ja pääseoksissa, jotka aiheuttavat vaahdon muodostumista ja jäämiä normaalin pinnan sisäpinnalle.pipetinkärjet.
Käyttötarkoituksesta ja annosteltavan nesteen tyypistä riippuen on valittava oikea pipetointitekniikka (1) ja sopivat laitteet. Pesuaineita sisältäville liuoksille suositellaan suorasyöttöjärjestelmää tai niin sanottuja "alhaisen retention" pipettikärkiä vaihtoehtona ilmatyynypipeteille. VaikutusACE-pipetin kärkiperustuu erityisen hydrofobiseen pintaan. Pesuaineita sisältävät nesteet eivät jätä jäämäkalvoa sisä- tai ulkopuolelle, joten liuoksen hävikki voidaan minimoida.
Kaikkien komponenttien tarkan annostelun lisäksi on myös tärkeää, ettei valmisteisiin tapahdu kontaminaatiota. Pelkkä erittäin puhdaslaatuisten kulutustarvikkeiden käyttö ei riitä, koska ilmatyynypipetissä pipetoitaessa voi syntyä aerosoleja, jotka jäävät pipettiin. Aerosolissa mahdollisesti oleva DNA voi siirtyä näytteestä toiseen seuraavassa pipetointivaiheessa ja johtaa siten kontaminaatioon. Edellä mainitut suorasyrjäytysjärjestelmät voivat myös minimoida tämän riskin. Ilmatyynypipeteissä on järkevää käyttää suodatinkärkiä suojaamaan pipetin kartiota roiskeilta, aerosoleilta ja biomolekyyleiltä.
Julkaisun aika: 06.12.2022