Pro úspěšné amplifikační reakce je nezbytné, aby jednotlivé reakční složky byly v každém přípravku přítomny ve správné koncentraci. Dále je důležité, aby nedošlo ke kontaminaci.
Zejména když je třeba nastavit mnoho reakcí, osvědčilo se připravit tzv. master mix namísto pipetování každého činidla zvlášť do každé nádobky. Komerčně dostupné jsou předkonfigurované směsi, do kterých se přidávají pouze složky specifické pro vzorek (primer) a voda. Alternativně si lze master mix připravit sami. V obou variantách se směs distribuuje do každé PCR nádobky bez templátu a jednotlivé vzorky DNA se přidávají samostatně na konci.
Použití master mixu má několik výhod: Zaprvé se snižuje počet kroků pipetování. Tímto způsobem se minimalizuje jak riziko chyb uživatele během pipetování, tak riziko kontaminace a samozřejmě se šetří čas. V principu je také vyšší přesnost pipetování, protože se dávkují větší objemy. To je snadno pochopitelné při kontrole technických údajů pipet: Čím menší je dávkovaný objem, tím vyšší mohou být odchylky. Skutečnost, že všechny přípravky pocházejí ze stejné nádoby, má pozitivní vliv na homogenitu (pokud jsou dobře promíchány). To také zlepšuje reprodukovatelnost experimentů.
Při přípravě master mixu by se měl přidat alespoň 10 % objemu navíc (např. pokud je potřeba 10 příprav, vypočítejte na základě 11), aby se i poslední nádoba správně naplnila. Tímto způsobem lze kompenzovat (mírné) nepřesnosti pipetování a vliv ztráty vzorku při dávkování roztoků obsahujících detergenty. Detergenty jsou obsaženy v enzymatických roztocích, jako jsou polymerázy a master mixy, což způsobuje tvorbu pěny a zbytků na vnitřním povrchu normálních...špičky pipet.
V závislosti na aplikaci a typu dávkované kapaliny je třeba zvolit správnou pipetovací techniku (1) a vybrat vhodné zařízení. Pro roztoky obsahující detergenty se doporučuje systém s přímým výtlačným tlakem nebo tzv. pipetovací špičky s „nízkou retencí“ jako alternativa k pipetám se vzduchovým polštářem. ÚčinekŠpička pipety ACEje založen na obzvláště hydrofobním povrchu. Tekutiny obsahující čisticí prostředky nezanechávají na vnitřní ani vnější straně usazeniny, takže lze minimalizovat ztráty roztoku.
Kromě přesného dávkování všech složek je také důležité, aby nedošlo ke kontaminaci přípravků. Nestačí používat spotřební materiál s vysokou čistotou, protože proces pipetování v pipetě se vzduchovým polštářem může produkovat aerosoly, které v pipetě zůstávají. DNA, která může být obsažena v aerosolu, se může v následujícím kroku pipetování přenést z jednoho vzorku do druhého a vést tak ke kontaminaci. Výše uvedené systémy přímého vytlačování mohou toto riziko také minimalizovat. U pipet se vzduchovým polštářem má smysl používat filtrační špičky k ochraně kužele pipety zachycením postříkání, aerosolů a biomolekul.
Čas zveřejnění: 6. prosince 2022