Per reazzioni d'amplificazione riesciute, hè necessariu chì i cumpunenti individuali di a reazione sianu prisenti in a cuncentrazione curretta in ogni preparazione. Inoltre, hè impurtante chì ùn si verifichi alcuna contaminazione.
In particulare quandu parechje reazzioni devenu esse messe in opera, hè statu stabilitu di preparà una cusì detta miscela maestra invece di pipettà ogni reagente separatamente in ogni vasu. E miscele preconfigurate sò dispunibili in u cummerciu, in quale si aghjunghjenu solu cumpunenti specifichi di u campione (primer) è acqua. In alternativa, a miscela maestra pò esse preparata da sè stessu. In e duie varianti, a miscela hè distribuita à ogni vasu PCR senza mudellu è u campione di DNA individuale hè aghjuntu separatamente à a fine.
L'usu di una miscela maestra hà parechji vantaghji: Prima, u numeru di passi di pipettazione singuli hè riduttu. In questu modu, sia u risicu d'errori di l'utente durante u pipettaggio sia u risicu di contaminazione sò minimizzati è, benintesa, si risparmia tempu. In principiu, a precisione di pipettazione hè ancu più alta, postu chì si dosanu volumi più grandi. Questu hè faciule da capisce quandu si verificanu i dati tecnichi di e pipette: Più chjucu hè u vulume dosatu, più alte ponu esse e deviazioni. U fattu chì tutte e preparazioni venenu da u listessu vasu hà un effettu pusitivu nantu à l'omogeneità (se ben mischiate). Questu migliora ancu a riproducibilità di l'esperimenti.
Quandu si prepara a miscela maestra, si deve aghjunghje almenu 10% di vulume supplementu (per esempiu, se sò necessarie 10 preparazioni, calculà nantu à a basa di 11), affinchì ancu l'ultimu vasu si riempia currettamente. In questu modu, si ponu cumpensà l'imprecisioni (lievi) di pipettamentu è l'effettu di a perdita di campione quandu si dosanu suluzioni chì cuntenenu detergente. I detergenti sò cuntenuti in suluzioni enzimatiche cum'è e polimerasi è e miscele maestre, causendu a furmazione di schiuma è residui nantu à a superficia interna di e miscele nurmali.punte di pipetta.
Sicondu l'applicazione è u tipu di liquidu da distribuisce, a tecnica di pipettamentu curretta (1) deve esse scelta è l'attrezzatura adatta deve esse selezziunata. Per e soluzioni chì cuntenenu detergenti, si cunsiglia un sistema di spustamentu direttu o i cosiddetti punte di pipetta "à bassa ritenzione" cum'è alternativa à e pipette à cuscinu d'aria. L'effettu diPunta di pipetta ACEhè basatu annantu à una superficia particularmente idrofoba. I liquidi chì cuntenenu detergenti ùn lascianu micca una pellicola residuale à l'internu è à l'esternu, affinchì a perdita di suluzione possi esse minimizzata.
Oltre à u dosaggio esattu di tutti i cumpunenti, hè ancu impurtante chì ùn si verifichi alcuna contaminazione di e preparazioni. Ùn basta micca aduprà consumabili di alta purezza, perchè u prucessu di pipettazione in una pipetta à cuscinu d'aria pò pruduce aerosoli chì restanu in a pipetta. U DNA chì pò esse cuntenutu in l'aerosol pò esse trasferitu da un campione à l'altru in a tappa di pipettazione successiva è cusì purtà à a contaminazione. I sistemi di spustamentu direttu citati sopra ponu ancu minimizà stu risicu. Per e pipette à cuscinu d'aria hà sensu aduprà punte di filtru per prutege u conu di a pipetta ritenendu schizzi, aerosoli è biomolecule.
Data di publicazione: 06 dicembre 2022