За успешни реакции на амплификация е необходимо отделните реакционни компоненти да присъстват в правилната концентрация във всеки препарат. Освен това е важно да не се получи замърсяване.
Особено когато трябва да се проведат много реакции, е установено, че вместо да се пипетира всеки реагент поотделно във всеки съд, се приготвя така наречената мастер микс. Предварително конфигурирани миксове се предлагат в търговската мрежа, в които се добавят само специфични за пробата компоненти (праймер) и вода. Алтернативно, мастер миксът може да се приготви самостоятелно. И в двата варианта сместа се разпределя във всеки PCR съд без шаблон и индивидуалната ДНК проба се добавя отделно накрая.
Използването на мастер микс има няколко предимства: Първо, броят на стъпките на единично пипетиране се намалява. По този начин се свеждат до минимум както рискът от потребителски грешки по време на пипетиране, така и рискът от замърсяване и, разбира се, се спестява време. По принцип точността на пипетиране също е по-висока, тъй като се дозират по-големи обеми. Това е лесно да се разбере при проверка на техническите данни на пипетите: Колкото по-малък е дозираният обем, толкова по-големи могат да бъдат отклоненията. Фактът, че всички препарати идват от един и същ съд, има положителен ефект върху хомогенността (ако са добре смесени). Това също така подобрява възпроизводимостта на експериментите.
При приготвяне на мастер микса трябва да се добави поне 10% допълнителен обем (напр. ако са необходими 10 препарата, изчислете на базата на 11), така че дори последният съд да се напълни правилно. По този начин могат да се компенсират (леките) неточности при пипетиране и ефектът от загубата на проба при дозиране на разтвори, съдържащи детергенти. Детергентите се съдържат в ензимни разтвори, като полимерази и мастер миксове, което води до образуване на пяна и остатъци по вътрешната повърхност на нормалните проби.накрайници за пипети.
В зависимост от приложението и вида на течността, която ще се дозира, трябва да се избере правилната техника на пипетиране (1) и да се избере подходящо оборудване. За разтвори, съдържащи детергенти, се препоръчва система за директно изместване или така наречените пипетни накрайници с „ниско задържане“ като алтернатива на пипетите с въздушна възглавница. Ефектът наВръх за пипета ACEе базиран на особено хидрофобна повърхност. Течностите, съдържащи детергенти, не оставят остатъчен филм от вътрешната и външната страна, така че загубата на разтвор може да бъде сведена до минимум.
Освен точното дозиране на всички компоненти, важно е също така да не се получи замърсяване на препаратите. Не е достатъчно да се използват консумативи с висока чистота, тъй като процесът на пипетиране в пипета с въздушна възглавница може да доведе до образуване на аерозоли, които остават в пипетата. ДНК, която може да се съдържа в аерозола, може да се прехвърли от една проба в следващата в следващата стъпка на пипетиране и по този начин да доведе до замърсяване. Споменатите по-горе системи за директно изместване също могат да сведат до минимум този риск. За пипети с въздушна възглавница е разумно да се използват филтърни накрайници, за да се защити конусът на пипетата чрез задържане на пръски, аерозоли и биомолекули.
Време на публикуване: 06 декември 2022 г.