Başarılı amplifikasyon reaksiyonları için, her bir preparatta ayrı ayrı reaksiyon bileşenlerinin doğru konsantrasyonda bulunması gerekir. Ayrıca, herhangi bir kontaminasyonun meydana gelmemesi de önemlidir.
Özellikle birçok reaksiyonun kurulması gerektiğinde, her reaktifi her bir kaba ayrı ayrı pipetlemek yerine, sözde bir ana karışım hazırlamak belirlenmiştir. Önceden yapılandırılmış karışımlar ticari olarak mevcuttur ve bunlara yalnızca numuneye özgü bileşenler (primer) ve su eklenir. Alternatif olarak, ana karışım kendiniz hazırlanabilir. Her iki varyantta da karışım, bir şablon olmadan her bir PCR kabına dağıtılır ve tek tek DNA örneği sonunda ayrı ayrı eklenir.
Master mix kullanmanın birkaç avantajı vardır: Birincisi, tek pipetleme adımlarının sayısı azalır. Bu şekilde hem pipetleme sırasında kullanıcı hatası riski hem de kontaminasyon riski en aza indirilir ve tabii ki zamandan tasarruf edilir. Prensip olarak, daha büyük hacimler dozlandığı için pipetleme doğruluğu da daha yüksektir. Pipetlerin teknik verilerini kontrol ederken bunu anlamak kolaydır: Dozlanan hacim ne kadar küçükse, sapmalar o kadar yüksek olabilir. Tüm preparatların aynı kaptan gelmesi, homojenlik üzerinde olumlu bir etkiye sahiptir (iyi karıştırılmışsa). Bu ayrıca deneylerin tekrarlanabilirliğini de artırır.
Ana karışımı hazırlarken, en az %10 ekstra hacim eklenmelidir (örneğin, 10 preparat gerekiyorsa, 11'i temel alarak hesaplayın), böylece son kap bile düzgün bir şekilde doldurulabilir. Bu şekilde, (hafif) pipetleme yanlışlıkları ve deterjan içeren çözeltileri dozlarken numune kaybının etkisi telafi edilebilir. Deterjanlar, polimerazlar ve ana karışımlar gibi enzim çözeltilerinde bulunur ve normalin iç yüzeyinde köpük oluşumuna ve kalıntılara neden olurpipet uçları.
Uygulamaya ve dağıtılacak sıvının türüne bağlı olarak, doğru pipetleme tekniği (1) seçilmeli ve uygun ekipman seçilmelidir. Deterjan içeren solüsyonlar için, hava yastıklı pipetlere alternatif olarak doğrudan yer değiştirme sistemi veya sözde "düşük tutma" pipet uçları önerilir. EtkisiACE PİPET ucuözellikle hidrofobik bir yüzeye dayanmaktadır. Deterjan içeren sıvılar iç ve dış tarafta kalıntı filmi bırakmaz, böylece çözelti kaybı en aza indirilebilir.
Tüm bileşenlerin tam dozajının yanı sıra, preparatlarda herhangi bir kontaminasyon olmaması da önemlidir. Yüksek saflıkta sarf malzemeleri kullanmak yeterli değildir, çünkü hava yastıklı bir pipetteki pipetleme işlemi pipette kalan aerosoller üretebilir. Aerosolde bulunabilecek DNA, bir sonraki pipetleme adımında bir numuneden diğerine aktarılabilir ve böylece kontaminasyona yol açabilir. Yukarıda belirtilen doğrudan yer değiştirme sistemleri de bu riski en aza indirebilir. Hava yastıklı pipetler için sıçramaları, aerosolleri ve biyomolekülleri tutarak pipet konisini korumak için filtre uçları kullanmak mantıklıdır.
Yayın zamanı: 06-Aralık-2022