Pentru reacții de amplificare reușite, este necesar ca componentele individuale ale reacției să fie prezente în concentrația corectă în fiecare preparat. În plus, este important să nu se producă nicio contaminare.
Mai ales atunci când trebuie configurate multe reacții, s-a stabilit necesitatea preparării unui așa-numit master mix în loc să se pipeteze fiecare reactiv separat în fiecare vas. În comerț sunt disponibile amestecuri preconfigurate, în care se adaugă doar componente specifice probei (primer) și apă. Alternativ, master mix-ul poate fi preparat de către utilizator. În ambele variante, amestecul este distribuit în fiecare vas PCR fără șablon, iar proba individuală de ADN este adăugată separat la final.
Utilizarea unui mix principal are mai multe avantaje: În primul rând, numărul de etape individuale de pipetare este redus. În acest fel, atât riscul erorilor utilizatorului în timpul pipetării, cât și riscul de contaminare sunt reduse la minimum și, bineînțeles, se economisește timp. În principiu, precizia pipetării este, de asemenea, mai mare, deoarece se dozează volume mai mari. Acest lucru este ușor de înțeles la verificarea datelor tehnice ale pipetelor: Cu cât volumul dozat este mai mic, cu atât abaterile pot fi mai mari. Faptul că toate preparatele provin din același vas are un efect pozitiv asupra omogenității (dacă sunt bine amestecate). Acest lucru îmbunătățește, de asemenea, reproductibilitatea experimentelor.
La prepararea amestecului principal, trebuie adăugat cel puțin 10% din volum suplimentar (de exemplu, dacă sunt necesare 10 preparate, se calculează pe baza a 11), astfel încât chiar și ultimul vas să se umple corect. În acest fel, se pot compensa (ușoarele) inexactități de pipetare și efectul pierderii probei la dozarea soluțiilor care conțin detergent. Detergenții sunt conținuți în soluțiile enzimatice, cum ar fi polimerazele și amestecurile principale, provocând formarea de spumă și reziduuri pe suprafața interioară a vaselor normale.vârfuri de pipetă.
În funcție de aplicație și de tipul de lichid care urmează să fie distribuit, trebuie aleasă tehnica corectă de pipetare (1) și trebuie selectat echipamentul adecvat. Pentru soluțiile care conțin detergenți, se recomandă un sistem de deplasare directă sau așa-numitele vârfuri de pipetă „cu retenție redusă” ca alternativă la pipetele cu pernă de aer. EfectulVârf de pipetă ACEse bazează pe o suprafață deosebit de hidrofobă. Lichidele care conțin detergenți nu lasă o peliculă reziduală la interior și la exterior, astfel încât pierderea de soluție poate fi redusă la minimum.
Pe lângă dozarea exactă a tuturor componentelor, este important să nu se producă nicio contaminare a preparatelor. Nu este suficient să se utilizeze consumabile de înaltă puritate, deoarece procesul de pipetare într-o pipetă cu pernă de aer poate produce aerosoli care rămân în pipetă. ADN-ul care poate fi conținut în aerosol poate fi transferat de la o probă la alta în etapa următoare de pipetare și astfel poate duce la contaminare. Sistemele de deplasare directă menționate mai sus pot, de asemenea, să minimizeze acest risc. Pentru pipetele cu pernă de aer, este logic să se utilizeze vârfuri de filtru pentru a proteja conul pipetei prin reținerea stropilor, aerosolilor și biomoleculelor.
Data publicării: 06 dec. 2022