Вовед
Што е екстракција на нуклеинска киселина?
Наједноставно кажано, екстракцијата на нуклеински киселини е отстранување на РНК и/или ДНК од примерокот и целиот непотребен вишок. Процесот на екстракција ги изолира нуклеинските киселини од примерокот и ги дава во форма на концентриран елуат, без разредувачи и загадувачи што би можеле да влијаат на сите последователни апликации.
Примени на екстракција на нуклеинска киселина
Прочистените нуклеински киселини се користат во мноштво различни апликации, кои се движат во повеќе различни индустрии. Здравствената заштита е можеби областа каде што се користат најмногу, при што прочистената РНК и ДНК се потребни за мноштво различни цели на тестирање.
Примените на екстракција на нуклеински киселини во здравствената заштита вклучуваат:
- Секвенционирање од следната генерација (NGS)
- Генотипизација на SNP базирана на амплификација
- Генотипизација базирана на низи
- Варење со рестриктивни ензими
- Анализи со употреба на модифицирачки ензими (на пр. лигација и клонирање)
Исто така, постојат и други области покрај здравствената заштита каде што се користи екстракција на нуклеинска киселина, вклучувајќи, но не ограничувајќи се на тестирање за татковство, форензика и геномика.
Кратка историја на екстракција на нуклеински киселини
Екстракција на ДНКдатира одамна, а првата позната изолација е извршена од швајцарскиот лекар Фридрих Мишер во 1869 година. Мишер се надевал дека ќе ги реши фундаменталните принципи на животот со одредување на хемискиот состав на клетките. Откако не успеал со лимфоцитите, тој успеал да добие суров талог од ДНК од леукоцити пронајдени во гној на фрлени завои. Тој го направил ова со додавање киселина, а потоа и алкалија во клетката за да ја напушти цитоплазмата на клетката, а потоа развил протокол за одвојување на ДНК од другите протеини.
По револуционерното истражување на Мишер, многу други научници продолжија да напредуваат и да развиваат техники за изолирање и прочистување на ДНК. Едвин Џозеф Кон, научник за протеини, разви многу техники за прочистување на протеините за време на Втората светска војна. Тој беше одговорен за изолирање на фракцијата на серумски албумин од крвната плазма, што е важно за одржување на осмотскиот притисок во крвните садови. Ова беше клучно за одржување на животот на војниците.
Во 1953 година, Френсис Крик, заедно со Розалинд Френклин и Џејмс Вотсон, ја утврдија структурата на ДНК, покажувајќи дека таа е составена од два нишки долги ланци на нуклеотиди на нуклеинска киселина. Ова револуционерно откритие им го отвори патот на Меселсон и Стал, кои беа во можност да развијат протокол за центрифугирање со градиент на густина за да ја изолираат ДНК од бактериите E. Coli, демонстрирајќи полуконзервативна репликација на ДНК за време на нивниот експеримент во 1958 година.
Техники на екстракција на нуклеински киселини
Кои се 4-те фази на екстракција на ДНК?
Сите методи на екстракција се сведуваат на истите основни чекори.
Нарушување на клеткитеОваа фаза, позната и како лиза на клетките, вклучува разградување на клеточниот ѕид и/или клеточната мембрана, со цел ослободување на интрацелуларните течности што ги содржат нуклеинските киселини од интерес.
Отстранување на несакани остатоци. Ова ги вклучува мембранските липиди, протеините и другите несакани нуклеински киселини кои можат да се мешаат во апликациите што се спроведуваат понатаму.
Изолација. Постојат голем број различни начини за изолирање на нуклеинските киселини од интерес од прочистениот лизат што сте го создале, кои спаѓаат во две главни категории: растворен или цврст (видете го следниот дел).
Концентрација. Откако нуклеинските киселини ќе бидат изолирани од сите други загадувачи и разредувачи, тие се презентираат во високо концентриран елуат.
Два вида на екстракција
Постојат два вида екстракција на нуклеински киселини – методи базирани на раствор и методи во цврста состојба. Методот базиран на раствор е познат и како метод на хемиска екстракција, бидејќи вклучува употреба на хемикалии за разградување на клетката и пристап до нуклеинскиот материјал. Ова може да се користи или органски соединенија како што се фенол и хлороформ, или помалку штетни и затоа попрепорачани неоргански соединенија како што се протеиназа К или силика гел.
Примери за различни методи на хемиска екстракција за разградување на клетка вклучуваат:
- Осмотско пукање на мембраната
- Ензимско варење на клеточниот ѕид
- Растворливост на мембраната
- Со детергенти
- Со алкален третман
Техниките во цврста состојба, познати и како механички методи, вклучуваат искористување на начинот на кој ДНК комуницира со цврста подлога. Со избирање на зрно или молекула на која ДНК ќе се врзе, но аналитот нема, можно е да се одделат двете. Примери за техники на екстракција во цврста фаза вклучуваат употреба на силициум диоксид и магнетни зрнца.
Објаснување за екстракција со магнетни зрна
Метод на екстракција со магнетни зрнца
Потенцијалот за екстракција со употреба на магнетни зрна за прв пат беше препознаен во американски патент поднесен од Тревор Хокинс, за истражувачката институција на Институтот Вајтхед. Овој патент потврдува дека е можно да се екстрахира генетски материјал со врзување за цврст носач, што може да биде магнетна зрна. Принципот е да се користи високо функционализирана магнетна зрна на која ќе се врзе генетскиот материјал, која потоа може да се одвои од супернатантот со примена на магнетна сила на надворешноста на садот што го содржи примерокот.
Зошто да се користи екстракција со магнетни зрна?
Технологијата за екстракција со магнетни зрна станува сè поприсутна, поради потенцијалот што го има за брзи и ефикасни процедури за екстракција. Во последно време се развиваат високо функционализирани магнетни зрна со соодветни пуферски системи, што овозможи автоматизација на екстракцијата на нуклеински киселини и работен тек кој е многу лесен за користење и економичен. Исто така, методите за екстракција со магнетни зрна не вклучуваат чекори на центрифугирање што можат да предизвикаат сили на смолкнување кои ги разбиваат подолгите парчиња ДНК. Ова значи дека подолгите нишки на ДНК остануваат недопрени, што е важно во геномското тестирање.
Време на објавување: 25 ноември 2022 година