Per il successo delle reazioni di amplificazione, è necessario che i singoli componenti della reazione siano presenti nella corretta concentrazione in ogni preparato. Inoltre, è fondamentale che non si verifichino contaminazioni.
Soprattutto quando è necessario impostare numerose reazioni, si è affermata la necessità di preparare una cosiddetta master mix anziché pipettare ogni reagente separatamente in ogni contenitore. Sono disponibili in commercio miscele preconfigurate, in cui vengono aggiunti solo componenti specifici per il campione (primer) e acqua. In alternativa, la master mix può essere preparata autonomamente. In entrambe le varianti, la miscela viene distribuita in ciascun contenitore per PCR senza stampo e il singolo campione di DNA viene aggiunto separatamente alla fine.
L'utilizzo di una master mix presenta diversi vantaggi: in primo luogo, si riduce il numero di singoli passaggi di pipettaggio. In questo modo, si riduce al minimo sia il rischio di errori da parte dell'utente durante il pipettaggio sia il rischio di contaminazione e, naturalmente, si risparmia tempo. In linea di principio, anche la precisione di pipettaggio è maggiore, poiché vengono dosati volumi maggiori. Questo è facile da comprendere consultando i dati tecnici delle pipette: minore è il volume dosato, maggiori possono essere le deviazioni. Il fatto che tutti i preparati provengano dallo stesso contenitore ha un effetto positivo sull'omogeneità (se ben miscelati). Ciò migliora anche la riproducibilità degli esperimenti.
Durante la preparazione del master mix, è necessario aggiungere almeno il 10% di volume in più (ad esempio, se sono necessarie 10 preparazioni, calcolare sulla base di 11), in modo che anche l'ultimo contenitore venga riempito correttamente. In questo modo, è possibile compensare (lievi) imprecisioni di pipettaggio e l'effetto della perdita di campione durante il dosaggio di soluzioni contenenti detergenti. I detergenti sono contenuti in soluzioni enzimatiche come polimerasi e master mix, causando la formazione di schiuma e residui sulla superficie interna delle normali soluzioni.punte per pipette.
A seconda dell'applicazione e del tipo di liquido da erogare, è necessario scegliere la tecnica di pipettaggio corretta (1) e selezionare l'attrezzatura appropriata. Per soluzioni contenenti detergenti, si raccomanda l'utilizzo di un sistema a spostamento diretto o dei cosiddetti puntali a "bassa ritenzione" come alternativa alle pipette a cuscino d'aria. L'effetto diPunta ACE PIPETTESi basa su una superficie particolarmente idrofobica. I liquidi contenenti detergenti non lasciano residui né all'interno né all'esterno, riducendo al minimo la perdita di soluzione.
Oltre al dosaggio esatto di tutti i componenti, è anche importante che non si verifichi alcuna contaminazione dei preparati. Non è sufficiente utilizzare materiali di consumo ad elevata purezza, poiché il processo di pipettaggio in una pipetta a cuscino d'aria può produrre aerosol che rimangono nella pipetta. Il DNA eventualmente contenuto nell'aerosol può essere trasferito da un campione all'altro nella successiva fase di pipettaggio e quindi causare contaminazione. I sistemi a spostamento diretto sopra menzionati possono anche ridurre al minimo questo rischio. Per le pipette a cuscino d'aria è consigliabile utilizzare puntali con filtro per proteggere il cono della pipetta trattenendo schizzi, aerosol e biomolecole.
Data di pubblicazione: 06-12-2022