Para que as reaccións de amplificación teñan éxito, é necesario que os compoñentes individuais da reacción estean presentes na concentración correcta en cada preparación. Ademais, é importante que non se produza contaminación.
Especialmente cando hai que configurar moitas reaccións, estableceuse a posibilidade de preparar unha mestura mestra en lugar de pipetear cada reactivo por separado en cada recipiente. Comercialmente hai mesturas preconfiguradas dispoñibles, nas que só se engaden compoñentes específicos da mostra (primer) e auga. Alternativamente, a mestura mestra pode ser preparada por un mesmo. En ambas as variantes, a mestura distribúese a cada recipiente de PCR sen molde e a mostra de ADN individual engádese por separado ao final.
Empregar unha mestura mestra ten varias vantaxes: en primeiro lugar, redúcese o número de pasos de pipeteado individuais. Deste xeito, minimízanse tanto o risco de erros do usuario durante o pipeteado como o risco de contaminación e, por suposto, aforrase tempo. En principio, a precisión do pipeteado tamén é maior, xa que se dosifican volumes máis grandes. Isto é doado de entender ao comprobar os datos técnicos das pipetas: canto menor sexa o volume dosificado, maiores poden ser as desviacións. O feito de que todas as preparacións procedan do mesmo recipiente ten un efecto positivo na homoxeneidade (se están ben mesturadas). Isto tamén mellora a reproducibilidade dos experimentos.
Ao preparar a mestura mestra, débese engadir polo menos un 10 % de volume adicional (por exemplo, se se requiren 10 preparacións, calcular sobre a base de 11), para que mesmo o último recipiente se encha correctamente. Deste xeito, pódense compensar as (lixeiras) imprecisións no pipeteado e o efecto da perda de mostra ao dosificar solucións que conteñen deterxente. Os deterxentes están contidos en solucións encimáticas como as polimerases e as mesturas mestra, o que provoca a formación de escuma e residuos na superficie interna do normal...puntas de pipeta.
Dependendo da aplicación e do tipo de líquido que se vaia dispensar, débese escoller a técnica de pipeteado correcta (1) e seleccionar o equipo axeitado. Para solucións que conteñan deterxentes, recoméndase un sistema de desprazamento directo ou as denominadas puntas de pipeta de "baixa retención" como alternativa ás pipetas de colchón de aire. O efecto dePunta de pipeta ACEbaséase nunha superficie particularmente hidrofóbica. Os líquidos que conteñen deterxentes non deixan unha película residual no interior nin no exterior, polo que se pode minimizar a perda de solución.
Ademais da dosificación exacta de todos os compoñentes, tamén é importante que non se produza contaminación das preparacións. Non abonda con usar consumibles de alta pureza, porque o proceso de pipeteado nunha pipeta de colchón de aire pode producir aerosois que permanecen na pipeta. O ADN que pode estar contido no aerosol pode transferirse dunha mostra a outra no seguinte paso de pipeteado e, polo tanto, provocar contaminación. Os sistemas de desprazamento directo mencionados anteriormente tamén poden minimizar este risco. Para as pipetas de colchón de aire, ten sentido usar puntas de filtro para protexer o cono da pipeta retendo salpicaduras, aerosois e biomoléculas.
Data de publicación: 06-12-2022