Pour que les réactions d'amplification soient réussies, il est nécessaire que les composants individuels de la réaction soient présents à la concentration adéquate dans chaque préparation. De plus, il est important d'éviter toute contamination.
En particulier lorsque de nombreuses réactions doivent être mises en place, il a été établi qu'il est préférable de préparer un mélange maître plutôt que de pipeter chaque réactif séparément dans chaque récipient. Des mélanges préconfigurés sont disponibles dans le commerce, dans lesquels seuls les composants spécifiques à l'échantillon (amorce) et l'eau sont ajoutés. Il est également possible de préparer soi-même le mélange maître. Dans les deux cas, le mélange est distribué dans chaque récipient de PCR sans matrice et l'échantillon d'ADN individuel est ajouté séparément à la fin.
L'utilisation d'un master mix présente plusieurs avantages : tout d'abord, le nombre d'étapes de pipetage est réduit. Ainsi, le risque d'erreurs d'utilisation et de contamination est minimisé, et, bien sûr, le temps est économisé. En principe, la précision du pipetage est également supérieure, car des volumes plus importants sont dosés. Ceci est facile à comprendre en vérifiant les caractéristiques techniques des pipettes : plus le volume dosé est faible, plus les écarts peuvent être importants. Le fait que toutes les préparations proviennent du même récipient a un effet positif sur l'homogénéité (si le mélange est bien effectué). Cela améliore également la reproductibilité des expériences.
Lors de la préparation du mélange maître, il convient d'ajouter au moins 10 % de volume supplémentaire (par exemple, si 10 préparations sont nécessaires, calculer sur la base de 11), afin que même le dernier récipient soit correctement rempli. Cela permet de compenser les (légères) imprécisions de pipetage et l'effet de perte d'échantillon lors du dosage de solutions contenant des détergents. Les détergents sont contenus dans les solutions enzymatiques telles que les polymérases et les mélanges maîtres, ce qui entraîne la formation de mousse et de résidus à la surface interne des solutions normales.pointes de pipette.
Selon l'application et le type de liquide à distribuer, il convient de choisir la technique de pipetage (1) appropriée et de sélectionner l'équipement approprié. Pour les solutions contenant des détergents, un système de déplacement direct ou des pointes de pipette dites « à faible rétention » sont recommandés, en alternative aux pipettes à coussin d'air. L'effet deEmbout de pipette ACErepose sur une surface particulièrement hydrophobe. Les liquides contenant des détergents ne laissent pas de film résiduel à l'intérieur comme à l'extérieur, minimisant ainsi la perte de solution.
Outre le dosage précis de tous les composants, il est également important d'éviter toute contamination des préparations. L'utilisation de consommables de haute pureté ne suffit pas, car le pipetage dans une pipette à coussin d'air peut produire des aérosols qui restent dans la pipette. L'ADN éventuellement contenu dans l'aérosol peut être transféré d'un échantillon à l'autre lors de l'étape de pipetage suivante, entraînant ainsi une contamination. Les systèmes de déplacement direct mentionnés ci-dessus peuvent également minimiser ce risque. Pour les pipettes à coussin d'air, il est judicieux d'utiliser des pointes à filtre pour protéger le cône de la pipette en retenant les éclaboussures, les aérosols et les biomolécules.
Date de publication : 6 décembre 2022