برای واکنشهای تکثیر موفقیتآمیز، لازم است که اجزای واکنش به صورت جداگانه در غلظت صحیح در هر فرآورده وجود داشته باشند. علاوه بر این، مهم است که هیچ آلودگی رخ ندهد.
به خصوص وقتی که باید واکنشهای زیادی تنظیم شوند، به جای اینکه هر واکنشدهنده را جداگانه با پیپت به هر ظرف منتقل کنیم، معمولاً یک مخلوط اصلی (Master Mix) تهیه میشود. مخلوطهای از پیش آمادهشده به صورت تجاری در دسترس هستند که در آنها فقط اجزای خاص نمونه (پرایمر) و آب اضافه میشوند. به عنوان یک جایگزین، میتوانید مخلوط اصلی را خودتان تهیه کنید. در هر دو نوع، مخلوط بدون الگو در هر ظرف PCR توزیع میشود و نمونه DNA جداگانه در انتها اضافه میشود.
استفاده از مخلوط اصلی چندین مزیت دارد: اول، تعداد مراحل پیپتینگ تکی کاهش مییابد. به این ترتیب، هم خطر خطاهای کاربر در طول پیپتینگ و هم خطر آلودگی به حداقل میرسد و البته در زمان نیز صرفهجویی میشود. در اصل، دقت پیپتینگ نیز بالاتر است، زیرا حجمهای بزرگتری دوز میشوند. این موضوع هنگام بررسی دادههای فنی پیپتها به راحتی قابل درک است: هرچه حجم دوز شده کوچکتر باشد، انحرافات میتواند بیشتر باشد. این واقعیت که همه آمادهسازیها از یک ظرف تهیه میشوند، تأثیر مثبتی بر همگنی (در صورت مخلوط شدن خوب) دارد. این امر همچنین تکرارپذیری آزمایشها را بهبود میبخشد.
هنگام تهیه مخلوط اصلی، حداقل 10٪ حجم اضافی باید اضافه شود (مثلاً اگر 10 آمادهسازی مورد نیاز است، بر اساس 11 محاسبه کنید)، به طوری که حتی آخرین ظرف نیز به درستی پر شود. به این ترتیب، میتوان اشتباهات (جزئی) پیپتینگ و اثر از دست دادن نمونه هنگام تزریق محلولهای حاوی شوینده را جبران کرد. شویندهها در محلولهای آنزیمی مانند پلیمرازها و مخلوطهای اصلی وجود دارند که باعث تشکیل کف و باقی ماندن بقایایی روی سطح داخلی ظروف معمولی میشوند.نوک پیپت.
بسته به کاربرد و نوع مایعی که باید توزیع شود، باید روش صحیح پیپتینگ (1) و تجهیزات مناسب انتخاب شود. برای محلولهای حاوی مواد شوینده، سیستم جابجایی مستقیم یا به اصطلاح نوک پیپتهای "با احتباس کم" به عنوان جایگزینی برای پیپتهای بالشتک هوا توصیه میشود. تأثیرنوک پیپت ACEبر پایه یک سطح آبگریز ویژه ساخته شده است. مایعات حاوی مواد شوینده، لایهای از مواد باقی مانده را در داخل و خارج از خود به جا نمیگذارند، به طوری که از دست دادن محلول به حداقل میرسد.
علاوه بر دوز دقیق تمام اجزا، مهم است که هیچ گونه آلودگی در آمادهسازیها رخ ندهد. استفاده از مواد مصرفی با خلوص بالا کافی نیست، زیرا فرآیند پیپتینگ در پیپت بالشتک هوا میتواند آئروسلهایی تولید کند که در پیپت باقی میمانند. DNA موجود در آئروسل میتواند در مرحله پیپتینگ بعدی از یک نمونه به نمونه دیگر منتقل شود و در نتیجه منجر به آلودگی شود. سیستمهای جابجایی مستقیم ذکر شده در بالا نیز ممکن است این خطر را به حداقل برسانند. برای پیپتهای بالشتک هوا، استفاده از نوک فیلتر برای محافظت از مخروط پیپت با حفظ پاششها، آئروسلها و مولکولهای زیستی منطقی است.
زمان ارسال: دسامبر-06-2022