Edukate amplifikatsioonireaktsioonide jaoks on vajalik, et igas preparaadis oleksid üksikud reaktsioonikomponendid õiges kontsentratsioonis. Lisaks on oluline, et ei tekiks saastumist.
Eriti kui on vaja ette valmistada palju reaktsioone, on välja kujunenud nn põhisegu valmistamine, selle asemel et iga reagenti eraldi igasse anumasse pipeteerida. Kaubanduslikult on saadaval eelkonfigureeritud segud, kuhu lisatakse ainult proovispetsiifilisi komponente (praimer) ja vett. Teise võimalusena saab põhisegu ise valmistada. Mõlema variandi puhul jaotatakse segu igasse PCR-anumasse ilma matriitsita ja individuaalne DNA-proov lisatakse lõpus eraldi.
Põhisegu kasutamisel on mitu eelist: esiteks väheneb üksikute pipeteerimisetappide arv. Sel viisil minimeeritakse nii kasutajavigade oht pipeteerimise ajal kui ka saastumisoht ja loomulikult säästetakse aega. Põhimõtteliselt on ka pipeteerimise täpsus suurem, kuna doseeritakse suuremaid koguseid. Seda on pipettide tehniliste andmete kontrollimisel lihtne mõista: mida väiksem on doseeritud maht, seda suuremad võivad olla kõrvalekalded. Asjaolu, et kõik preparaadid pärinevad samast anumast, mõjutab positiivselt homogeensust (kui need on hästi segatud). See parandab ka katsete reprodutseeritavust.
Põhisegu valmistamisel tuleks lisada vähemalt 10% lisamahtu (nt kui on vaja 10 preparaati, arvutada 11 alusel), et isegi viimane anum täidetaks korralikult. Sel viisil saab kompenseerida (väikseid) pipeteerimise ebatäpsusi ja proovikao mõju detergendi sisaldavate lahuste doseerimisel. Detergendid sisalduvad ensüümilahustes, näiteks polümeraasides ja põhisegudes, põhjustades vahu teket ja jääke normaalsete anumate sisepinnale.pipetiotsad.
Sõltuvalt rakendusest ja väljastatava vedeliku tüübist tuleks valida õige pipeteerimistehnika (1) ja sobiv seade. Detergentide sisaldavate lahuste puhul on soovitatav kasutada otseväljasurumise süsteemi või õhkpadjaga pipettide alternatiivina nn madala retentsiooniga pipetiotsi.ACE pipeti otspõhineb eriti hüdrofoobsel pinnal. Pesuaineid sisaldavad vedelikud ei jäta sise- ega välispinnale jääkkihti, nii et lahuse kadu saab minimeerida.
Lisaks kõigi komponentide täpsele doseerimisele on oluline ka see, et preparaate ei saastataks. Kõrge puhtusastmega kulumaterjalide kasutamisest ei piisa, sest õhkpadjaga pipeti pipeteerimisprotsessi käigus võivad tekkida aerosoolid, mis jäävad pipetti. Aerosoolis sisalduv DNA võib järgmises pipeteerimisetapis ühelt proovilt teisele üle kanduda ja seega saastuda. Eespool mainitud otsese nihutamise süsteemid võivad seda riski samuti minimeerida. Õhkpadjaga pipettide puhul on mõistlik kasutada filtriotsikuid, et kaitsta pipeti koonust pritsmete, aerosoolide ja biomolekulide eest.
Postituse aeg: 06. dets. 2022