Para que las reacciones de amplificación sean exitosas, es necesario que los componentes individuales de la reacción estén presentes en la concentración correcta en cada preparación. Además, es fundamental evitar cualquier contaminación.
Especialmente cuando se deben preparar muchas reacciones, se ha establecido la preparación de una mezcla maestra en lugar de pipetear cada reactivo por separado en cada recipiente. Existen mezclas preconfiguradas disponibles comercialmente, en las que solo se añaden los componentes específicos de la muestra (cebador) y agua. Como alternativa, la mezcla maestra puede prepararse usted mismo. En ambas variantes, la mezcla se distribuye a cada recipiente de PCR sin plantilla y la muestra de ADN individual se añade por separado al final.
El uso de una mezcla maestra ofrece varias ventajas: en primer lugar, se reduce el número de pasos de pipeteo. De esta forma, se minimizan tanto el riesgo de errores del usuario durante el pipeteo como el de contaminación y, por supuesto, se ahorra tiempo. En principio, la precisión del pipeteo también es mayor, ya que se dosifican mayores volúmenes. Esto se comprende fácilmente al consultar las características técnicas de las pipetas: cuanto menor sea el volumen dosificado, mayores serán las desviaciones. El hecho de que todas las preparaciones provengan del mismo recipiente favorece la homogeneidad (si la mezcla está bien hecha). Esto también mejora la reproducibilidad de los experimentos.
Al preparar la mezcla maestra, se debe añadir al menos un 10 % de volumen adicional (p. ej., si se requieren 10 preparaciones, calcular a partir de 11), para que incluso el último recipiente se llene correctamente. De esta manera, se pueden compensar las (ligeras) imprecisiones de pipeteo y el efecto de la pérdida de muestra al dosificar soluciones que contienen detergentes. Los detergentes se encuentran en soluciones enzimáticas, como las polimerasas y las mezclas maestras, lo que provoca la formación de espuma y residuos en la superficie interna de las soluciones normales.puntas de pipeta.
Dependiendo de la aplicación y del tipo de líquido a dispensar, se debe elegir la técnica de pipeteo correcta (1) y el equipo apropiado. Para soluciones que contienen detergentes, se recomienda un sistema de desplazamiento directo o las denominadas puntas de pipeta de baja retención como alternativa a las pipetas de cámara de aire. El efecto dePunta de pipeta ACESe basa en una superficie especialmente hidrófoba. Los líquidos que contienen detergentes no dejan una película residual en el interior ni en el exterior, lo que minimiza la pérdida de solución.
Además de la dosificación exacta de todos los componentes, también es importante evitar la contaminación de las preparaciones. No basta con utilizar consumibles de alta pureza, ya que el proceso de pipeteo en una pipeta de cojín de aire puede generar aerosoles que permanecen en la pipeta. El ADN que pueda contener el aerosol puede transferirse de una muestra a otra en el siguiente paso de pipeteo, provocando así contaminación. Los sistemas de desplazamiento directo mencionados anteriormente también pueden minimizar este riesgo. En las pipetas de cojín de aire, conviene utilizar puntas con filtro para proteger el cono de la pipeta, reteniendo salpicaduras, aerosoles y biomoléculas.
Hora de publicación: 06-dic-2022