Für erfolgreiche Amplifikationsreaktionen ist es notwendig, dass die einzelnen Reaktionskomponenten in jedem Ansatz in der richtigen Konzentration vorliegen. Darüber hinaus ist es wichtig, dass keine Kontamination auftritt.
Insbesondere wenn viele Reaktionen angesetzt werden müssen, hat es sich bewährt, einen sogenannten Mastermix herzustellen, anstatt jedes Reagenz einzeln in jedes Gefäß zu pipettieren. Es sind vorkonfigurierte Mixe kommerziell erhältlich, denen lediglich probenspezifische Komponenten (Primer) und Wasser zugesetzt werden. Alternativ kann der Mastermix auch selbst hergestellt werden. In beiden Varianten wird der Mix ohne Template auf die einzelnen PCR-Gefäße verteilt und die individuelle DNA-Probe am Ende separat hinzugefügt.
Die Verwendung eines Mastermixes bietet mehrere Vorteile: Erstens reduziert sich die Anzahl der einzelnen Pipettierschritte. Dadurch wird sowohl das Risiko von Anwenderfehlern beim Pipettieren als auch das Kontaminationsrisiko minimiert und natürlich Zeit gespart. Auch die Pipettiergenauigkeit ist grundsätzlich höher, da größere Volumina dosiert werden. Dies lässt sich leicht anhand der technischen Daten von Pipetten nachvollziehen: Je kleiner das dosierte Volumen, desto höher können die Abweichungen ausfallen. Dass alle Ansätze aus demselben Gefäß stammen, wirkt sich (bei guter Durchmischung) positiv auf die Homogenität aus. Dies verbessert zudem die Reproduzierbarkeit der Experimente.
Bei der Herstellung des Mastermixes sollten mindestens 10 % zusätzliches Volumen hinzugefügt werden (z. B. wenn 10 Ansätze benötigt werden, rechnen Sie mit 11), damit auch das letzte Gefäß korrekt gefüllt wird. Auf diese Weise können (leichte) Pipettierungenauigkeiten und der Effekt von Probenverlusten bei der Dosierung von Detergens-haltigen Lösungen ausgeglichen werden. Detergenzien sind in Enzymlösungen wie Polymerasen und Mastermixen enthalten und verursachen Schaumbildung und Rückstände an der Innenoberfläche von normalenPipettenspitzen.
Abhängig von der Anwendung und der Art der zu dosierenden Flüssigkeit sollte die richtige Pipettiertechnik (1) und das entsprechende Gerät gewählt werden. Für Lösungen mit Detergenzien werden ein Direktverdrängungssystem oder sogenannte „Low Retention“-Pipettenspitzen als Alternative zu Luftpolsterpipetten empfohlen. Die Wirkung vonACE PIPETTE Spitzebasiert auf einer besonders hydrophoben Oberfläche. Reinigungsmittelhaltige Flüssigkeiten hinterlassen innen und außen keinen Film, sodass der Lösungsverlust minimiert werden kann.
Neben der exakten Dosierung aller Komponenten ist es wichtig, dass keine Kontamination der Präparate auftritt. Die Verwendung hochreiner Verbrauchsmaterialien reicht nicht aus, da beim Pipettieren mit einer Luftpolsterpipette Aerosole entstehen können, die in der Pipette verbleiben. Die darin enthaltene DNA kann beim nächsten Pipettierschritt von einer Probe auf die nächste übertragen werden und so zu Kontaminationen führen. Die oben genannten Direktverdrängungssysteme können dieses Risiko ebenfalls minimieren. Bei Luftpolsterpipetten ist die Verwendung von Filterspitzen sinnvoll, um den Pipettenkonus zu schützen und Spritzer, Aerosole und Biomoleküle zurückzuhalten.
Veröffentlichungszeit: 06.12.2022