Perquè les reaccions d'amplificació siguin reeixides, cal que els components individuals de la reacció estiguin presents en la concentració correcta a cada preparació. A més, és important que no es produeixi cap contaminació.
Especialment quan s'han de configurar moltes reaccions, s'ha establert la possibilitat de preparar una barreja mestra en lloc de pipetejar cada reactiu per separat a cada recipient. Comercialment hi ha mescles preconfigurades disponibles, en les quals només s'afegeixen components específics de la mostra (primer) i aigua. Alternativament, la barreja mestra es pot preparar vosaltres mateixos. En ambdues variants, la barreja es distribueix a cada recipient de PCR sense plantilla i la mostra d'ADN individual s'afegeix per separat al final.
L'ús d'una mescla mestre té diversos avantatges: en primer lloc, es redueix el nombre de passos de pipeteig individuals. D'aquesta manera, es minimitzen tant el risc d'errors de l'usuari durant el pipeteig com el risc de contaminació i, per descomptat, s'estalvia temps. En principi, la precisió del pipeteig també és més alta, ja que es dosifiquen volums més grans. Això és fàcil d'entendre quan es comproven les dades tècniques de les pipetes: com més petit sigui el volum dosificat, més grans poden ser les desviacions. El fet que totes les preparacions provinguin del mateix recipient té un efecte positiu en l'homogeneïtat (si es barregen bé). Això també millora la reproductibilitat dels experiments.
Quan es prepara la mescla mestre, s'ha d'afegir com a mínim un 10% de volum addicional (per exemple, si es requereixen 10 preparacions, es calcula sobre la base d'11), de manera que fins i tot l'últim recipient s'ompli correctament. D'aquesta manera, es poden compensar les (lleus) imprecisions de pipeteig i l'efecte de la pèrdua de mostra en dosificar solucions que contenen detergent. Els detergents estan continguts en solucions enzimàtiques com ara les polimerases i les mescles mestres, cosa que provoca la formació d'escuma i residus a la superfície interna de les mescles normals.puntes de pipeta.
Segons l'aplicació i el tipus de líquid que s'hagi de dispensar, s'ha de triar la tècnica de pipeteig correcta (1) i seleccionar l'equip adequat. Per a solucions que contenen detergents, es recomana un sistema de desplaçament directe o les anomenades puntes de pipeta de "baixa retenció" com a alternativa a les pipetes amb coixí d'aire. L'efecte dePunta de pipeta ACEes basa en una superfície particularment hidròfoba. Els líquids que contenen detergents no deixen cap pel·lícula residual a l'interior ni a l'exterior, de manera que es pot minimitzar la pèrdua de solució.
A més de la dosificació exacta de tots els components, també és important que no es produeixi cap contaminació de les preparacions. No n'hi ha prou amb utilitzar consumibles d'alta puresa, ja que el procés de pipeteig en una pipeta de coixí d'aire pot produir aerosols que romanen a la pipeta. L'ADN que pot contenir l'aerosol es pot transferir d'una mostra a la següent en el següent pas de pipeteig i, per tant, provocar contaminació. Els sistemes de desplaçament directe esmentats anteriorment també poden minimitzar aquest risc. Per a les pipetes de coixí d'aire té sentit utilitzar filtres per protegir el con de la pipeta retenint esquitxades, aerosols i biomolècules.
Data de publicació: 06-12-2022