Za uspješne reakcije amplifikacije, neophodno je da pojedinačne komponente reakcije budu prisutne u ispravnoj koncentraciji u svakom preparatu. Osim toga, važno je da ne dođe do kontaminacije.
Posebno kada je potrebno postaviti mnogo reakcija, utvrđeno je da se umjesto pipetiranja svakog reagensa zasebno u svaku posudu priprema takozvana glavna smjesa. Komercijalno su dostupne unaprijed konfigurirane smjese u koje se dodaju samo komponente specifične za uzorak (primer) i voda. Alternativno, glavna smjesa se može pripremiti i samostalno. U obje varijante, smjesa se distribuira u svaku PCR posudu bez predloška, a pojedinačni uzorak DNK se dodaje zasebno na kraju.
Korištenje master miksa ima nekoliko prednosti: Prvo, smanjuje se broj pojedinačnih koraka pipetiranja. Na taj način se minimizira i rizik od korisničkih grešaka tokom pipetiranja i rizik od kontaminacije, a naravno se štedi i vrijeme. U principu, tačnost pipetiranja je također veća, jer se doziraju veće zapremine. To je lako razumjeti prilikom provjere tehničkih podataka pipeta: Što je manja dozirana zapremina, to mogu biti veća odstupanja. Činjenica da svi preparati dolaze iz iste posude pozitivno utiče na homogenost (ako se dobro izmiješa). To također poboljšava ponovljivost eksperimenata.
Prilikom pripreme glavne smjese, treba dodati najmanje 10% dodatne zapremine (npr. ako je potrebno 10 priprema, izračunati na osnovu 11), tako da se i posljednja posuda pravilno napuni. Na taj način se mogu kompenzirati (male) nepreciznosti pipetiranja i učinak gubitka uzorka pri doziranju otopina koje sadrže deterdžente. Deterdženti se nalaze u otopinama enzima kao što su polimeraze i glavne smjese, što uzrokuje stvaranje pjene i ostataka na unutrašnjoj površini normalnih...vrhovi pipeta.
U zavisnosti od primjene i vrste tečnosti koja se dozira, treba odabrati ispravnu tehniku pipetiranja (1) i odabrati odgovarajuću opremu. Za rastvore koji sadrže deterdžente, preporučuje se sistem direktnog istiskivanja ili takozvani vrhovi pipeta sa „niskim zadržavanjem“ kao alternativa za pipete sa vazdušnim jastukom. UčinakACE vrh za pipetuzasniva se na posebno hidrofobnoj površini. Tečnosti koje sadrže deterdžente ne ostavljaju film ostataka sa unutrašnje i spoljašnje strane, tako da se gubitak rastvora može svesti na minimum.
Pored preciznog doziranja svih komponenti, važno je i da ne dođe do kontaminacije preparata. Nije dovoljno koristiti potrošni materijal visoke čistoće, jer proces pipetiranja u pipeti sa zračnim jastukom može proizvesti aerosole koji ostaju u pipeti. DNK koja se može nalaziti u aerosolu može se prenijeti iz jednog uzorka u drugi u sljedećem koraku pipetiranja i tako dovesti do kontaminacije. Gore spomenuti sistemi direktnog istiskivanja također mogu smanjiti ovaj rizik. Za pipete sa zračnim jastukom ima smisla koristiti filterske vrhove kako bi se zaštitio konus pipete zadržavanjem prskanja, aerosola i biomolekula.
Vrijeme objave: 06.12.2022.